Использование мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени для диагностики ИППП

Использование мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени для диагностики ИППП

Введение.

Одна из основных причин воспалительных заболеваний урогенитального тракта – инфекции, возбудители которых передаются половым путем (ИППП), представляющие собой достаточно разнообразную группу микроорганизмов. За развитием клинического синдрома могут стоять разные возбудители ИППП. Помимо отсутствия специфических клинических признаков, на основании которых можно установить этиологию заболевания, существенную проблему представляют полимикробные ассоциации, включающие представителей патогенной и условно-патогенной флоры, составляющих, по крайней мере, половину случаев ИППП. Современные эпидемиологические данные показывают, что уретриты у мужчин наиболее часто ассоциированы с Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Ureaplasma spp. (Ureaplasma parvum иUreaplasma urealyticum) Эти же возбудители вызывают воспалительные процессы у женщин.

Активно используемый в диагностике ИППП метод ПЦР помимо высокой чувствительности и специфичности позволяет унифицировать всю процедуру лабораторного исследования для разных возбудителей на основе единого способа обработки клинического материала и универсального режима проведения реакции. Современная модификация ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РРВ) позволяет проводить комплексные исследования, минимизирует риск контаминации за счет того, что детекция продуктов амплификации проходит в закрытой пробирке и существенно упрощает требования к организации лаборатории.

Цель нашего исследования была разработать тест-систему в формате «мультиплекс», для выявления C.trachomatis, M.genitalium иUreaplasma в процессе одной реакции.

Материалы и методы.

Тест-система «Амплисенс C.trachomatis/ M.genitalium/ Ureaplasma-FRT» была создана на основе существующих ПЦР-тест-систем с детекцией в режиме реального времени «Амплисенс C.trachomatis-FRT», «Амплисенс M.genitalium-FRT» и «Амплисенс Ureaplasma-FRT» и позволяет амплифицировать фрагменты генома указанных микроорганизмов в одной пробирке (см. Рис. 1).

Рис. 1

А) «Обычная» ПЦР                               Б) Мультиплекс ПЦР

Учитывая, что C.trachomatis и M.genitalium являются облигатными паразитами необходимо их достоверное выявление в клиническом материале даже в минимальных концентрациях. Таким образом, основным требованием формата «мультиплекс» является сохранение аналитической чувствительности в отношении каждого из возбудителей в условиях многократного избытка двух других. Подобное условие трудновыполнимо при электрофоретическом методе детекции вследствие различных длин получаемых фрагментов и, следовательно, различной эффективности амплификации (короткие фрагменты амплифицируются с большей эффективностью, чем длинные). При использовании ПЦР-РРВ эффективность амплификации возбудителей увеличивается за счет сокращения длины амплифицируемых фрагментов. Помимо праймеров к фрагментам ДНК указанных микроорганизмов реакционная смесь содержит гибридизационные зонды, за счет которых и происходит дифференциация возбудителей. Данные зонды включали различные флуоресцентные метки, позволяющие регистрировать флуоресцентные сигналы с разными длинами волн на приборах «RotorGene 3000» и «RotorGene 6000» (Corbett Research, Австралия) c 4 и 5-канальной оптической системой. Зонд для детекции C.trachomatis содержит флуорофор Fam, Ureaplasma spp. флуорофор Joe и M.genitalium флуорофор Rox. Для контроля качества выполнения теста был введен внутренний контрольный образец (ВКО), зонд которого мечен флуорофором Cy5.

Результаты. Аналитическая чувствительность предложенной мультиплекс тест-системы изучалась в модельных экспериментах. Для этих целей были выбраны клинические образцы, в которых концентрация ДНК C.trachomatis находилась в пределах 10³ копий в мл. В данные образцы дополнительно были добавлены два рекомбинантных образца, содержащих фрагменты Ureaplasma и M.genitalium в концентрациях 10⁹ копий ДНК в мл (см. Рис.2).

А) каналы Green и Yellow

Б) каналы Orange и Yellow

При этом следует отметить, что подобные концентрации возбудителей в лабораторной практике (10⁹ коп/мл) встречаются крайне редко и вероятность того, что два из трех возбудителей будут находиться в подобных концентрациях, ничтожно мала. Результатом данного исследования было сохранение заявленной для моноплекс-тест-систем аналитической чувствительности и отсутствие конкуренции для одного из возбудителей даже в случае наличия в образце двух других в избыточных концентрациях. Данная мультиплекс-ПЦР-тест-система была апробирована на клиническом материале – мазков из уретры, полученных от пациентов с клинико-лабораторными признаками негонококкового уретрита. В работу были взяты 84 образца, содержащих C.trachomatis и 42 образца, содержащих M.genitalium. Из них 29 и 12 соответственно были ассоциированы с Ureaplasma spp. Ассоциации C.trachomatis иM.genitalium в нашем исследовании обнаружено не было. Эти результаты были подтверждены с помощью моноплекс-ПЦР-тест-систем. Были получены 2 дискордантных образца – отрицательные значения для Ureaplasma spp. в одном случае для мультиплекс-тест-системы и в другом для моноплекс-тест-системы. Полученные дискорданты связаны с низкой концентрацией возбудителя в образцах. После перестановки в обоих случаях Ureaplasma была выявлена двумя форматами ПЦР. Примеры полученных данных представлены на Рис. 3 и в таблице 1.

Таблица 1

	C.trachomatis	Ureaplasma	M.genitalium	C.trachomatis/ Ureaplasma	M.genitalium / Ureaplasma	C.trachomatis/ M.genitalium
Мультиплекс	55	0	30	29	12	0
Моноплекс	84	41	42

Рис 3

А) каналы Green и Yellow

Б) каналы Orange и Red

Заключение.

Впервые в России была разработана ПЦР-тест-система в формате «мультиплекс» с детекцией продуктов реакции в режиме реального времени для диагностики инфекций урогенитального тракта. В ходе исследования полученные результаты показали, что диагностическая чувствительность мультиплекс-ПЦР-тест-системы совпадает с чувствительностью моноплекс-ПЦР-тест-систем. При этом использование мультиплекс-ПЦР-тест-систем сокращает количество манипуляций при проведении анализа, за счет чего снижается вероятность ошибок и уменьшается общая продолжительность исследования. Кроме того, использование формата «мультиплекс» позволит увеличить пропускную способность лаборатории в 1,5-2 раза без увеличения приборной базы за счет меньшей загрузки амплификаторов.