Количественное исследование Chlamydia trachomatis в клиническом материале методами культуры клеток и ПЦР «в реальном времени»

Меню

Категории

Количественное исследование Chlamydia trachomatis в клиническом материале методами культуры клеток и ПЦР «в реальном времени»

Введение: Chlamydia trachomatis - внутриклеточный паразит, который относят к безусловно патогенными микроорганизмам. В развитых странах наиболее широко распространены серотипы C. trachomatis, вызывающие урогенитальную хламидийную инфекцию, которая, в первую очередь у женщин, может долгое время протекать с минимальными клиническими проявлениями, приводя к развитию восходящей инфекции с поражением органов малого таза. В связи с этим, выявление возбудителя является достаточным основанием для назначения антибактериальной терапии вне зависимости от выраженности клинических проявлений, а существующие рутинные лабораторные тесты диагностики инфекции носят качественный характер. В тоже время в ряд зарубежных исследований свидетельствует о том, что уровень бактериальной нагрузки может иметь определенное клиническое (патогенетическое, прогностическое) значение. В частности, в работе [Brunham R.C., et al, 1983] было показано, что уровень секреторных анти-C. trachomatis IgA играющих значительную роль в элиминации хламидийной инфекции, имеет обратную зависимость от концентрации возбудителя в цервикальном канале. В работе [Geisler W.M., et al., 2001] была установлена связь между бактериальной нагрузкой C. trachomatis с уровнем воспалительной реакции и клиническими проявлениями инфекции. Наконец, существует точка зрения, что рецидив хламидийной инфекции, не связанный с повторным инфицированием после проведенной антибактериальной терапии, вызван развитием гетеротипической устойчивости в результате высокой бактериальной нагрузки до начала лечения. В связи с этим, количественное определение возбудителя может иметь большое значение в выборе тактики этиотропной терапии [Horner P. Et al, 2006]. Однако описанные методы количественного определения C. trachomatis в большинстве работ были основаны на методе культуры клеток, который, как известно, трудоемок и трудно поддается стандартизации. Технология ПЦР с детекцией продуктов амплификации в реальном времени (Real-Time PCR) дает возможность разработать рутинный лабораторный тест для количественной оценки содержаний С. trachomatis в клиническом материале, отражающий уровень бактериальной нагрузки.

Целью настоящего исследования явилась разработка теста на основе метода ПЦР «в реальном времени» для определения концентрации ДНК C.trachomatis в клиническом образце и сравнение полученных результатов с методом культуры клеток.

Материал и методы: Клинические образцы (соскобы из цервикального канала женщин и уретры мужчин) собирали в пробирки с 1 мл сахарозо-фосфатного буфера и хранили до тестирования при минус 70ºС. Всего было исследовано 27 образцов. Для культивирования хламидий использовали монослои клеток McCoy в 96-луночных планшетах. Концентрацию хламидий в клиническом образце представляли как число включение образующих единиц (ВОЕ) в 1 мл пробы после подсчета количества хламидийных включений как минимум в 10 полях.

Для проведения ПЦР с детекцией флуоресцентного сигнала в реальном времени были разработаны олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченные гибридизационные зонды, комплементарные к фрагменту генома C. trachomatis. Для количественной оценки были приготовлены ДНК-стандарты - разведения ДНК C. trachomatis с известной концентрацией, определенной методом предельных разведений [Rodrigo AG, 1997]. Амплификация с детекцией в реальном времени проводилась в приборе для Real-Time PCR Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Австралия). С помощью программного обеспечения к прибору относительно ДНК-стандартов рассчитывались неизвестные значения концентраций ДНК C. trachomatis в клинических образцах с учетом эффективности экстракции ДНК. Для учета эффективности экстракции ДНК C. trachomatis из клинических образцов был разработан рекомбнантный внутренний контрольный образец (ВКО) с известной концентрацией, добавляемый в каждый клинический образец. Экстракцию ДНК проводили с использованием набора ДНК-сорб-АМ производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Эффективность экстракции рассчитывалась как отношение концентрации ВКО, определенной после проведения пробоподготовки клинического образца к исходной концентрации ВКО.

Результаты: Количественные показатели определения C. trachomatis с помощью ПЦР в реальном времени и методом культуры клеток представлены в таблице.

Результаты количественного анализа клинических проб на Chlamydia trachomatis методами ПЦР в реальном времени и культуры клеток

№ пациента	ПЦР–РВ ГЭ /мл *	Культура клеток, ВОЕ/мл**
209	1х10⁵	1х10²
224	5х10⁵	2х10²
249	2х10⁷	1х10³
267	7х10⁵	1х10²
274	5х10⁵	5х10¹
285	2х10⁸	4х10⁴
359	7х10⁵	2х10¹
362	2х10⁶	4х10³
384	1х10⁶	4х10³
437	2х10⁶	2х10³
466	7х10⁵	2х10³
473	9х10³	Отриц.
532	3х10⁶	1х10¹
535	4х10⁴	Отриц.
537	3х10⁵	Отриц.
561	5х10⁴	8х10²
567	1х10⁸	8х10⁴
608	1х10⁴	Отриц.
720	3х10⁵	1х10³
726	4х10⁵	Отриц.
754	8х10⁴	Отриц.
760	3х10⁵	Отриц.
777	7х10³	Отриц.
812	3х10⁷	1х10³
870	1х10⁵	1х10¹
904	7х10⁴	Отриц.
1020	1х10⁷	4х10⁴

* ПЦР-РВ – ПЦР в реальном времени, ГЭ/мл – геномные эквиваленты в 1 мл

** ВОЕ/мл – включения образующие единицы в 1 мл

Значение концентраций варьировало в интервале от 7х10³до 1х10⁸ ГЭ в мл (среднее 5х10⁵ ГЭ/мл). Сравнение полученных значений концентраций ДНК C. trachomatis с количеством включений на лунку микропланшета в культуральном тесте, выраженных в ВОЕ/мл (включения образующие единицы в 1 мл) показало невысокий коэффициент корреляции (r=0.63) между двумя тестами. Образцы с концентрацией ДНК C. trachomatis меньше 10⁴ГЭ/мл были отрицательными в культуральном тесте, а образцам со значениями концентрацией ДНК C. trachomatis больше 10⁶ГЭ/мл имели максимальные значения ВОЕ/мл. Однако, образцы с промежуточными значениями концентраций ДНК C.trachomatis 10⁴-10⁵ГЭ/мл могли быть как положительными, так и отрицательными в культуральном тесте. Достоверность наличия C. trachomatis в образцах, которые оказались отрицательными при культуральном исследовании, была подтверждена с использованием независимого амплификационного метода НАСБА (NASBA), с помощью которого в этих образцах были обнаружены рРНК C. trachomatis [Шипицына Е.В. с соавт., 2005].

Заключение: Разработана методика на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая определять концентрацию ДНК C. trachomatis в клиническом материале. Метод культуры клеток обладает более низкой чувствительностью и не может использоваться для адекватного определения бактериальной нагрузки при хламидийной инфекции. Требуются дальнейшие исследования, направленные на стандартизацию условий получения клинического материала.

Возврат к списку