Новые подходы в диагностике состояния вагинальной экосистемы на основе количественной ПЦР с детекцией сигнала в реальном времени

Новые подходы в диагностике состояния вагинальной экосистемы на основе количественной ПЦР с детекцией сигнала в реальном времени

Введение.

Инфекции влагалища – наиболее частая проблема с которой сталкиваются в практической работе акушеры-гинекологи и дерматовенерологи, поскольку это наиболее частая причина обращения пациенток к врачу. Вагинальные инфекции в большинстве случаев сопровождаются воспалительными реакциями или патологическими выделениями,  которые являются причиной дискомфорта и беспокойства пациенток. Наиболее часто встречаются три формы заболевания – бактериальный вагиноз (БВ) - более половины случаев, вульвовагинальный кандидоз (ВВК) и трихомониаз.

Согласно МКБ-10, шифр N89.0, бактериальный вагиноз – это инфекционный невоспалительный клинический синдром полимикробной этиологии, связанный с дисбиозом вагинального биотопа, обусловленный прекращением или значительным снижением роста лактобацилл, которые продуцируют перекись водорода и обеспечивают колонизационную резистентность вагинального биотопа, большим количеством условно-патогенных микроорганизмов, в основном анаэробных.

Причины, которые могут приводить к угнетению роста лактобацилл и дисбиозу влагалища, разделяют на эндогенные и экзогенные. К эндогенным относят изменение гормонального статуса (снижение концентрации эстрогенов, которые способствуют накоплению в эпителиальных клетках влагалища гликогена – питательного субстрата лактобактерий), дисбактериоз кишечника и снижение местной иммунологической реактивности. К экзогенным относят применение массивных курсов антибиотиков широкого спектра, наличие воспалительных заболеваний, применение гормональных средств, иммунодепрессантов и спермицидов.  

Клиническая диагностика БВ основана на критериях Amsel, предложенных в 1984 году, включающих наличие патологических выделений, значения pH вагинального отделяемого >4.5, положительный результат аминотеста (появление рыбного запаха при смешивании вагинального отделяемого с 10%-ным раствором KOH в равных частях), наличие ключевых клеток в неокрашенном препарате при микроскопическом исследовании. Диагноз БВ ставится при наличии трех из этих критериев. Следует отметить, что клинические признаки БВ носят субъективный характер и по этой причине чувствительность клинической диагностики, по данным разных авторов, не превышает 50% и требует обязательного лабораторного подтверждения.

Рутинная лабораторная диагностика БВ основана на изучении соотношения количества морфотипов лактобацилл и условно-патогенных бактерий (кокков, бацилл) и обнаружении ключевых клеток в окрашенных по Граму мазках. С целью стандартизовать этот метод лабораторной диагностики БВ в 1991 году были предложены критерии Ньюджента, основанные на 10-балльной системе оценки количества морфотипов. В России вместо критериев Ньюджента используют различные классификации вагинальных мазков. Так, например, по классификации Е.Ф. Киры, различают три степени «чистоты» влагалища. Первая степень – нормальное состояние биоценоза, характеризующееся преобладанием лактобактерий, и отсутствием или небольшим количеством грамотрицательной флоры. Вторая степень – промежуточное состояние, характеризующееся сниженным количеством лактобактерий и появлением разнообразных морфотипов грамположительных и грамотрицательных палочек и кокков. Третья степень – бактериальный вагиноз – преобладание смешанной бактериальной микрофлоры включая G.vaginalis, отсутствие или незначительное количество лактобактерий.  

Бактериологический метод может быть использован в дополнение к основным методам лабораторной диагностики БВ с целью оценить функциональное состояние лактобактерий (их способность продуцировать перекись водорода) и определить видовой состав и титр условно-патогенных микроорганизмов. Использование бактериологического метода в рутинной диагностике БВ затруднено вследствие его трудоемкости, необходимости использования специальных сред и специальных условий роста для анаэробных микроорганизмов, длительности проведения методик и низкой надежности результатов. Кроме того, в последнее время были обнаружены и изучены некультивируемые микроорганизмы, которые имеют сильную ассоциативную связь с БВ, например, Atopobium vaginae, Megasphaera sp., и др. Выявление этих микроорганизмов возможно только с помощью молекулярно-биологических методов, к которым относится полимеразная цепная реакция (ПЦР).

ПЦР уже давно используется для выявления G.vaginalis, которая является основным маркерным условно-патогенным микроорганизмом БВ. Этот микроорганизм выделялся из вагинального секрета женщин страдающих неспецифическим вагинитом и описан в 1955 году. Долгое время ошибочно считалось, что этот микроорганизм передается половым путем является этиологической причиной бактериального вагиноза. Однако высокая частота обнаружения G.vaginalis у женщин без признаков БВ (до 50%), а также ее выявление почти у 30% девственниц, опровергает это предположение. Поэтому любые методы качественного выявления G.vaginalis, используется ли для этой цели ПЦР или бактериология, без определения титра или концентрации микроорганизма, заведомо имеют низкую специфичность.

Ключевым моментом в развитии БВ является снижение концентрации лактобактерий, которые в норме присутствуют в количестве 10^8-10 клеток/мл вагинального отделяемого (ВО), а при БВ либо полностью отсутствуют, либо количество их снижено до 10^3-5 клеток/мл. Снижение протективной функции нормальной флоры влагалища в отношении условно-патогенных микроорганизмов, которые в норме присутствуют в незначительных количествах (например, концентрация G.vaginalis составляет 10^3-5 клеток/мл), приводит к повышению их концентрации на несколько порядков (до 10^8-10 клеток/мл). Таким образом, диагностика БВ должна основываться не столько на выявлении лактобацилл и G.vaginalis, сколько на определении концентрации обоих микроорганизмов и оценке степени преобладания одного над другим

В связи с этим, для диагностики БВ с помощью ПЦР особую актуальность приобрели методики определения концентрации микроорганизмов на основе ПЦР с детекцией результатов амплификации в реальном времени.

Целью настоящей работы была разработка методик количественного определения ДНК Lactobacillus sp. и Gardnerella vaginalis в отделяемом влагалища и оценка ассоциативной связи этих микроорганизмов с  БВ.

Материалы.

Для количественного определения ДНК Lactobacillus sp. и Gardnerella vaginalis использовали полимеразную цепную реакцию с детекцией результатов в реальном времени, на основе которой была разработана тест-система «Амплисенс Gardnerella vaginalis/Lactobacillus sp.-Титр-FRT». Количественное определение ДНК микроорганизмов в объеме клинического материала основано на использовании стандартных образцов с известной концентрацией ДНК выявляемых микроорганизмов. Результат выражали в геномных эквивалентах бактерий (ГЭ) на мл вагинального отделяемого (ВО) при условии стандартного забора материала (стандартный объем ВО в стандартном объеме транспортной среды). Также определяли коэффициент соотношения (КС) – разницу логарифма концентрации Lactobacillus sp. иGardnerella vaginalis.

Аналитическую чувствительность и разработанной методики определяли с использованием культур бактерий G.vaginalis и Lactobacillus gasseri . Чувствительность выявления ДНК G.vaginalis составила 500 клеток/мл, а чувствительность выявления Lactobacillus gasseri составила 1000 клеток/мл.

Оценку диагностической чувствительности и специфичности методик проводили на клинических образцах от 25 женщин с диагнозом БВ (группа БВ+) и от 76 женщин без БВ (норма).  Диагноз БВ был поставлен на основании клинических критериев Amsel и подтвержден при микроскопическом исследовании мазка окрашенного по Граму.

Результаты.

Данные, полученные в результате проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Средние концентрации ДНК Lactobacillus sp. иGardnerella vaginalis и КО в исследуемых группах.

 

Полученные данные свидетельствуют о высокой ассоциативной связи высокой концентрации ДНК Gardnerella vaginalis и низкой концентрации ДНК Lactobacillus sp с БВ. При использовании этих двух маркеров бактериального вагиноза, которые оцениваются в тесте «Амплисенс Gardnerella vaginalis/Lactobacillus sp.-Титр-FRT», можно с высокой эффективностью диагностировать БВ.

Выводы.

На основе ПЦР с детекцией в реальном времени, нами была разработана тест-система для количественного выявления ДНК Gardnerella vaginalis и Lactobacillus sp., которая с высокой эффективностью позволяет диагностировать бактериальный вагиноз.