Применение ПЦР с детекцией в режиме реального времени для проведения мониторинга ГМО в пищевых продуктах и сырье

Применение ПЦР с детекцией в режиме реального времени для проведения мониторинга ГМО в пищевых продуктах и сырье

Введение

В РФ разработана нормативная база, регламентирующая контроль над распространением генетически модифицированных организмов (ГМО), включающий экспертизу по оценке безопасности и регистрацию линий трансгенных растений, а также пост-регистрационный мониторинг пищевых продуктов на содержание ГМО. Мониторинг в первую очередь направлен на то, чтобы не допустить до потребителя ГМО, не зарегистрированные в реестре разрешённых для использования в РФ. Кроме того, исходя из принципа предосторожности, пост-регистрационный мониторинг контролирует правильность маркировки продукции, содержащей разрешённые ГМО, с целью информировать потребителя и дать возможность выбора при приобретении продуктов.

Для решения задач мониторинга необходимы надежные и доступные тесты, обнаруживающие рекомбинантную ДНК.  В связи с этим в ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии разработаны и производятся тест-системы и комплекты реагентов, позволяющие определять наличие ГМО, идентифицировать разрешенные для реализации в РФ ГМО и проводить количественную оценку содержания трансгенных растительных компонентов  в пищевых продуктах.

Цели

Целью исследования служила оценка эффективности работы тест-систем при проведении мониторинга пищевой продукции

Материалы и методы

В работе были использованы тест-системы производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора,  основанные на ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени на приборах Rotor Gene-3000/6000 (Corbett Research, Австралия) и iQ iCycler (Bio-Rad, США).

С их помощью можно обнаружить большинство из производимых в мире в промышленном масштабе линий трансгенной сои и кукурузы (по одновременному тестированию промотора 35S и терминатора NOS), идентифицировать в одном анализе все зарегистрированные в РФ линии сои (устойчивость к глифосату - 40-3-2 Монсанто, и устойчивость к глюфосинату аммония - 27-04-12, 55-147-127 Bayer CropScience), а также проводить количественную оценку содержания трансгенной сои (всех линий, содержащих промотор 35S) и трансгенной кукурузы (всех линий, содержащих промотор 35S).

Оценка эффективности работы тест-систем проводилась с использованием сертифицированных стандартов ГМО, выпускаемых Институтом контрольных материалов и методов (Institute for Reference Materials and Methods, Бельгия) и зашифрованной панели из 90 образцов пищевых продуктов, произведенных из бобов сои  или содержащих в качестве ингредиентов продукты их переработки (соевые бобы, изоляты соевого белка, концентраты соевого белка, мука соевая, заменители цельного молока, питательные смеси, БАД, улучшители, колбасы, пельмени). Панель образцов была сформирована из продуктов, которые тестировались ранее в ГУ НИИ Питания РАМН на наличие ГМО.

Результаты

Схема лабораторного исследования продуктов питания для выявления ГМО включает в себя несколько этапов: выявление регуляторных последовательностей (скрининг), идентификация ГМО, количественное определение содержания ГМО в продукте. Скрининговые исследования продуктов питания проводят, выявляя маркеры, которые встречаются в большинстве трансгенных растений, то есть промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) и терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens с помощью тест-систем «АмплиСенс ГМ соя FRT» и «АмплиСенс ГМ кукуруза FRT».

Идентификация линий трансгенной сои проводится после скрининга в образцах ДНК, содержащих последовательность промотора 35S и ДНК сои. Для решения вопроса о маркировке продукта и определения количественного содержания трансгенной сои и кукурузы в пищевой продукции и сырье разработаны тест-системы: «Ампликвант ГМ соя», «Ампликвант ГМ кукуруза». Тест-системы содержит праймеры и зонды для идентификации последовательности промотора 35S и геномной ДНК сои (кукурузы) одновременно в одной пробирке, что позволяет определять долю трансгенной сои (кукурузы) от всей сои (кукурузы), присутствующей в исследуемом образце. Относительное количество ГМО определяют по калибровочной прямой. Для обеспечения достоверности количественного анализа тест-системы укомплектованы калибровочными образцами - экстрактами ДНК, полученными из сертифицированных стандартов ГМО, выпускаемых Институтом контрольных материалов и методов (Institute for Reference Materials and Methods, Бельгия).

С целью обеспечения стабильности результатов тест-системы содержат наборы готовых к работе реагентов для каждого этапа анализа и контрольные образцы, позволяющие избежать ошибки при анализе результатов. Использованная в тест-системах методика экстракции ДНК гораздо менее трудоемка и более быстрая, чем традиционно используемый метод СТАБ, обеспечивает значительный выход растительной ДНК из продуктов (в том числе прошедших термическую обработку) и практически полностью удаляет ингибиторы ПЦР, тем самым, способствуя хорошей воспроизводимости результатов количественного анализа.

В процессе разработки тест-систем большое внимание уделялось оценке их эффективности, то есть аналитических характеристик – специфичности, чувствительности, предела детекции, предела количественного измерения, повторяемости и воспроизводимости результатов анализа, которая проводилась в соответствии с требованиями Объединенного Центра исследований ГМО (JRC) Европейского Союза, предъявляемыми к подобным разработкам. При оценке аналитической чувствительности тест-систем для скрининга, идентификации и количественного анализа  были получены одинаковые результаты – 5 геномных эквивалентов промотора 35S и терминатора NOS, 10 геномных эквивалентов геномной ДНК сои, 20 геномных эквивалентов геномной ДНК кукурузы в реакцию ПЦР. Воспроизводимость количественного анализа оценивалась по показателю коэффициент вариаций (процент отклонения от среднего значения) и составила 21%.
При тестировании зашифрованной панели было зарегистрировано практически полное совпадение с результатами анализа в ГУНИИ Питания РАМН при качественном тестировании, идентификации и при проведении количественного анализа.

Заключение

Производимые в течение ряда лет в ФГУН ЦНИИЭ тест-системы для мониторинга ГМО с различными вариантами детекции фрагментов ПЦР проходили лабораторные испытания на базах ФЦГиЭ Роспотребнадзора и ГУ НИИ питания РАМН. Тест-системы для количественного анализа рекомендованы в Методических Указаниях МУК 4.2.1913-04 «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания» для применения в лабораториях учреждений Госсанэпиднадзора.

В настоящее время разработаны новые тест-системы на основе ПЦР с  гибридизационно-флуоресцентной детекцией в мультиплексном формате, позволяющие проводить ускоренный скрининг и идентификацию. Результаты проведенных исследований показали высокую чувствительность и специфичность тест-систем и позволяют говорить об их эффективности при проведении мониторинга пищевых продуктов на этапах скрининга, идентификации и количественного анализа ГМО.