Применение стандартов лабораторной диагностики легионеллеза во время эпидемической вспышки пневмоний в городе Верхняя Пышма Свердловской области

За последние годы достигнут качественный прогресс в диагностике и профилактике легионеллеза, основанный на внедрении в практику современных стандартов лабораторной диагностики и количественном мониторинге возбудителя в потенциально опасных объектах окружающей среды. Применение международных стандартов лабораторной диагностики во время эпидемической вспышки пневмоний в городе Верхняя Пышма Свердловекой области позволило в сжатые сроки установить этиологический диагноз. Особое значение имело применение иммунохроматографического метода для выявления антигена легионелл в моче, входящего в стандарты диагностики ВОЗ, что позволило nодтвердить диагноз для больных, находившихся в реанимационном отделении, в течение 30 минут. Анализ потенциально опасных объектов окружающей среды в Верхней Пышме с помощью бактериологических методов и ПЦР в реальном времени позволил установить достаточно широкое распространение Legionella spp. в водных образцах из различных источников, преимущественно в некультивируемом состоянии. Эпидемически значимые изопяты Legionella pneumophila выделяли значительно реже и предварительный скрининг образцов с помощью ПЦР в реальном времени хорошо коррелировал с результатами культуральнога исследования. Применение современных стандартов молекулярного типирования легионелл, разработанных Европейской рабочей группой по легионеллезу, позволил охарактеризовать аллельный профиль выделенных штаммов.

Ключевые слова: легионеллёз, лабораторная диагностика, профилактика, мониторинг, ПЦР в реальном времени, окружающая среда, молекулярное типирование.

Введение

Несмотря на то, что легионелленая инфекция известна уже более 30 лет, достаточно хорошо изучены различные аспекты биологии и экологии возбудителя, разработаны методы диагностики и лечение, тем не менее легионеллез часто по традиции продолжают относить к категории недавно открытых и малоизученных инфекций. Во многом эта ситуация объясняется тем, что до недавнего времени легионеллез оставался труднодиагностируемой инфекцией. Даже в США, стране "первооткрывательнице" легионелл в конце 90-х годов прошлого века, техникой бактериологического выделения легионелл из клинического материала владели сотрудники не более 50% клинических микробиологических лабораторий.

Качественные изменения произошли в 1999 г., когда Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ), проанализировав опыт применения различных методов диагностики в странах с относительно высоким уровнем заболеваемости легионеллезом и при крупных эпидемических вспышках инфекции, подготовила стандарты лабораторной диагностики легионеллза. С 2002 г. эти же стандарты приняты в качестве диагностических критериев Европейской рабочей группой по легионеллезу.

В соответствии с упомянутыми стандартами диагноз легионеллеза в случае острой инфекции нижних дыхательных путей (клинически и рентгенологически подтвержденной) считается установленным:

• при выделении легионелл из отделяемого респираторного тракта или легочной ткани;
• при 4-кратном или более нарастании титра специфических антител к Legionella pneumophila в реакции непрямой иммунофлюоресценции;
• при определении специфического растворимого антигена легионелл в моче иммуноферментным или иммунохроматографическим методом.

При отсутствии сыворотки крови, взятой в ранние сроки болезни, выявление достоверно высокого уровня антител к L. pneumophila (1:128 и выше) в одиночной сыворотке методом непрямой иммунофлюоресценции поэволяет считать диагноз легионеллеза предположительно установленным. Аналогичным образом интерпретируются результаты, полученные на основании выявления возбудителя или его ДНК в респираторном секрете или легочной ткани с помощью прямой иммунофлюресценции или полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Стандарты лабораторной диагностики легионеллеза распространяются лишь на случаи заболеваний, вызванных штаммами L. pneumophila серогруппы 1. В то же время более 80% спорадических и групповых случаев легионеллеза вызваны штаммами данной серогруппы, а при крупных внебольничных вспышках легионеллеза этиологическое значение штаммов 1-й серогруппы показано в 98% случаев.

За менее чем 10-летний период стандартизации диагностики произошел качественный скачок в выявлении легионеллеза в мире. Так, ежегодно регистрируемое Европейской рабочей группой количество случаев легионеллеза выросло с 1160 в 1994 г. до 4588 в 2004 г. Причем основной рост произошел, начиная с 2000 г., т. е. после введения вышеупомянутых стандартов. Резко возросло и число выявляемых ежегодно групповых случаев и эпидемических вспышек инфекции - не менее 100 в год. Наиболее крупные и значимые из них представлены в табл. 1.

Таблица 1. Наиболее значимые эпидемические вспышки леrионеллеза в последние годы

Год	Страна	Количество заболевших (умерших)
1999	Голландия	242 (25)
1999	Бельгия	93 (5)
2000	Австралия	98 (8)
2001	Норвегия	28 (9)
2002	Испания	470 (9)
2002	Англия	179 (7)
2003	Морской круиз "Ocean Monarch"	9 (2)
2003-2004	Франция	86 (17)
2004	Швеция	32 (3)
2005	Норвегия	55 (10)
2006	Испания	122 (6)
2007	Россия, Верхняя Пышма	190 (5)

Основная роль в повышении эффективности диагностики легионеллеза принадлежит методу определения легионеллезного антигена в моче больных.

Еще в начале 80-х годов прошлого века было показано, что в самом начале болезни (2-3-е сутки) антиген возбудителя можно обнаружить в моче больного легионеллезом, причем сам возбудитель в моче отсутствует. Антиген термастабилен и может быть выявлен в течение примерно 30 дней после начала заболевания. В 1989 г. метод был стандартизован компаниями Binax (США) и Biotest (Германия), испытан 14 лабораториями Европейских стран (включая лабораторию легионеллеза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) и был рекомендован в качестве высокоспецифичного и чувствительного метода, позволяющего поставить окончательный диагноз на первой неделе заболевания.

Если непосредственно после введения стандарта определения антигена L. pneumophila в моче данный метод использовали для диагностики менее чем в 5% случаев, то в настоящее время метод применяют для постановки окончательного диагноза более чем в 90% подтвержденных случаев легионеллезной инфекии. Превосходство данного метода над традиционными, включенными в стандарт бактериологическим и серологическим методами состоит, прежде всего, в сроках исследования. Бактериологический метод занимает не менее 4-5 суток, причем требуются инвазивные процедуры для получения материала (бронхоскопия, биопсия), так как из мокроты, особенно после начала элютропной терапии, возбудитель удается выделить далеко не всегда. Выявление диагностического нарастания титров антител в реакции непрямой иммунофлюоресценции возможно лишь на третьей неделе заболевания, когда проведен курс антибиотикотерапии и исход заболенания обычно уже ясен. Необходимость, исследования парных сывороток определяет ретроснективный характер диагностики легионеллеза данным методом.

Метод определения легионеллезного антигена в моче обычно применяется в двух модификациях: иммуноферментный и иммунохроматографнческий тест. Они сопоставимы по чувствитrлыюстн, специфичности, времени анализа и применяются взависимости от задач исследования. Иммуноферментный метод позволяет количественно оценить наличие антигена и проверить одновременно более 80 образцов мочи, что важно при расследовании крупных эпидемических вспышек легионеллеэа. В то же время срок хранения тест-системы не нревышает 6 мес. Иммунохроматографические разовые тесты в индивидуальной упаковке хранятся не менее 2 лет, не требуют дополнительного оборудовання и используются для быстрой диагностики спорадических и групповых случаев легионеллезной инфекции.

Высокая эффективность стандартов лабораторной диагностики легионеллеза была продемонстрирована при расследовании эпидемической вспышки пневмоний в Верхней Пышме.

Материал и методы исследования

Материал от больных пневмонией (сывортка крови, моча, аутопсийный материал легочной ткани) был собран в городской бoльнице (Верхняя Пышма) и доставлен для исследования в специализиpoвaнныe лаборатории Екатсринбурга и Москвы. Определение ранних IgM-антител к L. pneumophila серогруппы 1 проводили в Екатеринбургском диагностическом центре с помоощыо тест-системы Vircell (Испания). Мочу больных на присутствие растворимого антигена L. pneumophila серогруппы 1 исследовали с помощью 2 иммунохроматографических тecт-систем - Binax SAS (США) и иммуноферментной тест-системы Biotest (Германия) в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи на среде BMPA (Oxoid, Великобритания).

Образцы окружающей среды (вода и смывы биопленок) в Bepxнeй Пышме были отобраны сотрудниками Центра гигиены в Свердловской области и исследовались в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи в соответствни с "Методическими yкaзаниями по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды". Для количественного определения ДНК легионелл в объектах окружающей среды с помощью ПЦР в реальном времени были выбраны следующие праймеры и флуоресцентные зонды: для выянления Legionella spp. - из последовательности гена, кодирующего 16S рРНК, для выявления L. pneumophila - из последовательности гена mip. Выбранные флуоресцентные зонды были линейными по типу TaqMan и содержали различные флуорофоры на 5' -конце и оответствующие им гасители на 3' -конце. Молекулярио-генетическое типирование выделенных штаммов легионелл осуществляли в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи в соответствии с STB протоколом Европейской рабочей группы по легионеллезу.

Результаты исследования

В середине июля 2007 г. в Верхней Пышме Свердловской области была выявлена эпидемическая вснышка легионеллезной инфекции. которая которая продолжалась около 3 недель. За период вспышки за медицинской помощью обратиличь более 200 человек с подозрением на легионеллезную пневмонию. Окончательный диагноз установлен 190 больным, этиологический диагноз подтвержден для 74 пациентов, в 5 случаях имел место летальный исход. Большая часть случаев заболеваний приходилась на период с 15 по 25 июля. Бактериологическис и вирусолоrические исследования, проводившиеся специалистами Минздравсоцразвития и Роспортебнадзора Свердловской области, познолили к 25 июля исключить из числа возможных этиологических агентов все потенциальные возбудители респираторных инфекций и пневмоний, за исключением легионелл. В пользу легионеллезной этиологии вспышки свидетельствовали и предварительные результаты эпидемиологического расследования, показавшие, что начало вспышки, с учетом инкубационного периода заболевания, составлявшего от 2 до 1О дней, коррелирует с запуском воды в систему горячего водоснабжения города после нескольких недель ремонтно-профилактических работ (ремонт Су ГРЭС, опрессовки).

Предварительный диагноз легионеллеза был поставлен 27 июля по результатам исследования сывороток крови 59 больных пневмонией с помощью иммуноферментной тест-системы для обнаружения иммуноглобулинов класса М к L. pneumophila серогруппы 1 (Vircell, Испания). Ранние IgМ-антитела к L. pneumophila серогруппы 1 были выявлены у 25 больных. Метод определения ранних IgM-антител к возбудителю легионеллеза не входит в стандарты лабораторной диагностики инфекции, так как в первую неделю заболевания возможны как выявление IgМ-антител, так и полное их отсутствие, особенно у пациентов с выраженным иммунодефицитом, а также перекрестные реакции с некоторыми возбудителями респираторных инфекций. Тем не менее, положительные результаты исследований данным методом у 42,4% обследованных позволили с высокой степенью вероятности предположить у них легионеллез.

При последующем применении стандартов лабораторной диагностики легионеллеза в качестве первого шага было выбрано применение иммунохроматографического метода для определения легионеллезного антигена в моче больных. Образцы мочи были взяты у группы наиболее тяжелых больных, находившихся в реанимационном отделении (8 человек). Исследование на выявление легионеллезного антигена в моче каждого больного было проведено 29 июля с помощью двух типов иммунохроматографических тест-систем: Binax Now и SAS Legionella test (США). В течение 30 мин положительные результаты, продублированные обеими тест-системами, были получены для 5 больных. Еще у двух пацентов при использовании тест-системы Binax Now были получены положительные результаты, но при применении SAS Legionella test результаты были сомнительными. У одного больного отрицательные результаты были нолучены при использовании обеих тест-систем. Параллельна 29 июля секционный материал от 2 умерших больных был исследован с помощью количественной модификации ПЦР с видоспецифическими праймерами на mip ген L. pneumophila. ДНК воэбудителя в высокой концентрации была выявлена в образцах легочной ткани пациентов, умерших от легионеллезной пневмонии.

Поскольку иммунохроматографический метод определения антигена в моче рекомендован ВОЗ и Европейской рабочей групной по леmонеллезу для окончательного подтверждения диагноза легионеллезной инфекции и положительные результаты, полученные данным методом, были дополнены с помощью ПЦР материала аутопсии, то 29 июля 2007 г. можно считать датой окончательного подтверждения легионеллезной этнологии вспышки инфекции (табл. 2).

Таблица 2. Методы лабораторной диагностики применявшиеся для установления диагноза легионеллезнои инфекции во время эпидемической вспышки пневмоний в Верхней Пышме 27 - 29 июля 2007 г.

Метод	Используемые материалы	Обследуемый контингент больных	Количество образцов	Позитивные образцы (%)	Время, затраченно на исследование	Место проведения исследований
Определение антигена иммунохроматографическим методом	Моча	Пациенты реанимации	8	7 (88%)	30 мин	НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва)
Выделение культуры легионелл	Секционный материал (легочная ткань)	Умершие	2	1 (50%)	5 сут	НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва)
ПЦР	Секционный материал (легочная ткань)	Умершие	2	2 (100%)	4 ч	ЦНИИ эпидемиологии (Москва)
Определение lgM антигена	Сыворотка крови	Все госпитализированные с диагнозом пневмония	59	25 (42,4%)	4 ч	Клинико-диагностический центр (Екатеринбург)

Следующим шагом прнменення стандартов стало использование бактериологического метода для исследования секционного материала (легочная ткань) от трех пациентов, умерших от пневмонин, и исследование 67 образцов мочи на наличие антигена с помощью количественного иммуноферментного метода (Biotest. Германия), взятых у больных 30 июля.

Применение иммуноферментного метода позволило в течение 4 ч количественно выявить легионеллезный антиген в 33 образцах мочи. Причем в образцах мочи, исследованных ранее иммунохроматографическим методом, от 7 тяжелых больных легионеллезом, находившихся в реанимационном отделении, кончентрация антигена была особенно велика, превосходя уровень рекомендованного положительного контроля в 8-10 раз.

Культура L. pneumophila серогруппы 1 была выделена из легочной ткани 1 из 3 умерших пациентов после 5 дней культивирования на буферном угольно- дрожжевом агаре (BCYE) с селективной добавкой, содержащей цефамандол, полимиксии и анизомицин (модификация данной среды называется также ВМРА). Последующая идентификация культуры с помощью бактериологических тестов, латекс-агглютинации, иммунофлюоресценции и ПЦР заняла 2 суток.

Помимо сбора клинического материала 30 июля были взяты на исследование образцы воды и смывы биопленок в местах наиболее вероятного присутствия легионелл в системе водоснабжения Верхней Пышмы и прилегающих окрестностей. Образцы исследовали бактериологически и с помощью ПЦР в реальном вpeмени (ПЦР-РВ) в соответствии с "Методическими указаниями по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды". Результаты ПЦР в peaльном времени свидетельствуют о широком pacнpocтpaнeнии Legionella spp. в природных и хозяйственных водных системах Верхней Пыпшы. Вместе с тем, выделение культур Legionella spp лишь из одного образца воды подтверждает низкую концентрацию непатогенных видов легионелл, находящихся в воде преимущественно в некультивируемом состоянии. Присутствие L. pneumophila выявляли значительно реже, но в данном случае корреляция ПЦР и результатов бактериологических исследований была болee выражена (табл. 3). В течение первой недели исследований культура L. pneumophila серогруппы 1 была выделена из биопленки с поверхности дренажного канала теплопункта 1. При повторном исследовании в сентябре-октябре 2007 г. образцов воды и биопленок, хранившихся при 4 С в концентрированном виде, с измененным режимом кислотной обработки, были выделены еще несколько культур L. pneumophila (см. табл. 3, табл. 4). Изолят L. pneumophila серогруппы 1 6ыл выделен из воды дренажного канала теплопункта 1. Еще 2 культуры L. pneumophila серогруппы 3 были выделены, соответственно, из смыва с душевой сетки в квартире больного легионеллезом и из технической воды промышленного предприятия. Три изолята Legionella spp. были выделены из одного из технических колодцев системы канализации Верхней Пышмы.

Таблица 3. Результаты исследования образцов окружающей среды в Верхней Пышме с помощью ПЦР-РВ на наличие Legionella spp. и Legionella pneumophila (образцы воды и смывы биопленок взяты 30.07.2007 г.)

Описание образца	Результаты оценки методом ПЦР-РВ		Выделенная культура
	Legionella spp.	Legionella pneumophila
Пробы воды от 30.07.07
Дренажная вода теплопункта 1	+	-	L. pneumophila серогруппа 1
Обводной трубопровод в теплопункте 2	+	-
Дренажный колодец, промывная вода после фильтра, СУГРЭС	+	-
Сбросный канал теплой воды	+	-
Вода из трубы подающего трубопровода теплопункта 1	-	-
Вода из колодца 1	+	-	Legionella spp.
Вода из колодца 2	+	-
Вода из фонтана № 1	+	-
Вода из фонтана № 2	+	-
Вода техническая промышленпого предприятия	+	+	L. pneumophila серогруппа 3
Смывы биопленок от 30.07.07
Смыв с поверхности дренажного канала теплопункта 1	+	+	L. pneumophila серогруппа 1
Смыв из дренажной трубы нз теплопункта 2	-	-
Смыв из дренажного колодца, СУГРЭС	+	-
Смыв из дренажного колодца над кромкой воды, СУГРЭС	-	-
Внутренняя поверхность трубы подающего трубопровода теплопункта 1	-	-
Смыв с сетки дренажного канала теплопункта 1	+	-
Смыв с душeвoй сетки в квартире больного 1	-	-
Смыв с душeвoй сетки в квартире больного 2	+	+	L. pneumophila серогруппа 3

Для 5 штаммов L. pneumophila, выделенных в районе вспышки легионеллеза, был определен аллельный профиль по протоколу STB EWGLI. В качестве референтного использовали штамм L. pneumophila Philadelphia-1 (АТСС 33152).

Таблица 4. Изоляты L. pneumophila и Legionella spp., выделенные при расследовании эпидемической вспышки легионеллеза в Верхней Пышме.

Изолят	Серогруппа L. pneumophila	Исследуемый материал	Срок выделения, сутки
Pyshma 1	1	Легочная ткань (секционный материал)	5
Pyshma 2	1	Смыв биопленки с поверхности дренажного канала теплопункта	8
Pyshma 3	3	Смыв с новерхности сетки душа в квартире заболевшего легионеллезом	6
Pyshma 4	1	Дренажная вода	7
Pyshma 5	3	Техническая вода	7
Pyshma 6		Вода из кoлодца 1 системы городского водоснабжения	6
Pyshma 7			6
Pyshma 8			8

Результаты молекулярного тпировання представлены в табл. 5, где отражены номера известных последовательностей базы данных EWGLI, которым в 100% соответствует нуклеотидная последовательность фрагментов генов выделенных штаммов. Из табл. 5 видно, что все 5 штаммов уникальны и отличаются между собой по последовательностям секвенированых фрагментов ДНК. По мишени asd идентичны штаммы Pyshma-2 и Pyshma-5, наибольшие отличия наблюдаются между штаммами Pyshma-3 и Pyshma-4. По мишени flaA идентичны Pyshma-2 и Pyshma-4. Наименьшее сходство имеют референтный штамм и Pyshma-3. По фрагменту pilE сходны 3 штамма: Pyshma-1, Pyshma-2 и Pyshma-3, а штамм Pyshma-5 идентичен референтному Philadelphia-1. Мишень mip продемонстрировала идентичность Pyshma-2 и Pyshma-4, proA - полное совпадение последовательностей штаммов Philadelphia-1, Pyshma-3 и Pyshma-4. Фрагменты гена mompS совнадают по последовательности у штаммов Pyshma-2 и Pyshma-4.

Таблица 5. Аллельный профиль проанализированных штаммов

Штамм	Номер аллеля
	flaA	pilE	asd	mip	momps	proA
Philadelphia-1, АТСС 33152	3	4	1	1	14	4
Pyshma-1	2	10	18	10	2	9
Pyshma-2	6	10	3	28	9	1
Pyshma-3	6	10	15	3	19	4
Pyshma-4	6	6	3	28	9	4
Pyshma-5	1	4	3	1	1	5

По полному набору аллелей наибольшее сходство с референтным имеет штамм Pyshma-5, также относящийся к первой серогруппе. Из штаммов, выделенных в районе вспышки заболевания, наибольшее сходство имеют штаммы Pyshma-2 и Pyshma-4.

Полученные результаты свидетельствуют о достаточно широком распространении L. pneumophila и Legionella spp. в водопроводной и хозяйственной воде в Верхней Пышме. Гетерогенность популяции возбудителя в водных системах характерна для легионелл, находящихся в своей естественной среде обитания. Селекция наиболее эпидемически значимых клонов возбудителя, по-видимому, может происходить как в составе биопленок, так и при непосредственном контакте с альвеолярными макрофагами человека, приводя к наиболее тяжелым случаям пневмоний.

Заключение

Применение различных методов лабораторной диагностики легионеллеза при расследовании эпидемической вспышки пневмоний в городе Верхняя Пышма подтвердило ключевую роль и высокую эффективность метода определения антигена легионелл в моче больных. Возможность получения достоверного реэультата, позволяющего поставить окончательный днагноз легионеллезной инфекции в течение 1-3 ч, открывает принципиально новые возможности для быстрой корректировки антибиотикотерапии больных с использованием макролидов, для организации эффективного эпидемиологического расследования и профилактических мероприятий.

Выделение культуры из клинического материала остается "золотым стандартом" диагностики, но требует не менее 6-7 дней. Кроме того, возможности этого метода, как и ПЦР, ограничены необходимостью инвазивных процедур, связанных с получением материала бронхоскопии и биопсии. При исследовании секционного материала от пациентов данные ограничения отсутствовали, но специальные требования к взятию и транспортировке материала на легионеллез могли оказать влияние на результаты бактериологического исследования. Культура выделена лишь из материала от одного пациента. Метод определения IgM -антител в сыворотке крови, так же как и различные модификации ПЦР, не входят в стандарты лабораторной диагностики, но их применение сыграло положительную роль для постановки предполагаемого диагноза или в качестве дополнительного подтверждающего теста. Быстрый анализ эпидемиологической ситуации с учетом возможных путей передачи возбудителя в сочетании с грамотным применением современных алгоритмов лабораторной диагностики легионеллеза позволил в течение 3 дней (27-29 июля) установить окончательный этиологический диагноз эпидемической вспышки.

Анализ распространения возбудителя в потенциально опасных водных системах Верхней Пышмы показал достаточно высокую эффективность сочетания бактериологических методов и ПЦР-РВ. Культуры легионелл были выделены в 5 образцах окружающей среды, а с помощью ПЦР-РВ присутетвие легионелл показано в 13 из 18 образцов. Результаты подтверждают необходимость организации количественного профилактического мониторинга легионелл в потенциально опасных водных объектах с особым акцентом на выявление наиболее эпидемически значимых штаммов L. pneumophila серогруппы 1.

Внедрение стандартов лабораторной диагностики легионеллеза с особым акцентом на выявление антигена легионелл в моче больных в первые дни заболевания, наряду с организацией мониторинга возбудителя в потенциально опасных водных системах в Российской Федерации, позволит не только быстро и достоверно выявлять спорадические случаи и эпидемические вспышки легионеллезной этиологии, осуществлять своевременное и эффективное лечение больных, но и обеспечит своевременное выявление потенциальных очагов легионеллезной инфекции и проведение необходимых противоэпидемических мероприятий.