Заказать звонокРазработка и апробация тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации видов уреаплазм и определения их концентрации в образцах из урогентального тракта
Разработка и апробация тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации видов уреаплазм и определения их концентрации в образцах из урогентального тракта
Бактерии рода Ureaplasma в настоящее время относят к условно-патогенным микроорганизмам, а медицинский термин "уреаплазмоз" официально не применяется. Под уреаплазмозом понимают воспалительный процесс в мочеполовых органах, когда при лабораторном обследовании обнаружена Ureaplasma и не выявлены безусловно- патогенные микроорганизмы, способные вызвать данное воспаление. Зависимость между инфицированием уреаплазмой и развитием острого воспалительного процесса остается недоказанной. Также пока обсуждается, но не доказана возможность проникновения уреаплазм через плодные оболочки, с последующим инфицированием плода, а также то, что уреаплазмы могут являться этиологической причиной преждевременных родов или рождения детей с дыхательной недостаточностью.
Распространенность уреаплазменной инфекции среди женщин детородного возраста чрезвычайно высока и в подавляющем большинстве случаев эта инфекция протекает в бессимптомной форме. Считается, что при бессимптомном течении, обсемененность слизистых оболочек уреаплазмой (концентрация в мл образца) низкая – 103 КОЕ/мл, а концентрация 104 КОЕ/мл считается клинически значимой. При этом в литературе отсутствуют публикации о каких-либо серьезных исследованиях, подтверждающих обоснованность этого утверждения.
Для определения титра живых уреаплазм в клиническом материале используют бактериологический метод – микрокультуральный тест, основанный на 10-кратных последовательных разведениях клинического материала с последующим посевом и определением титра колониеобразующих единиц (КОЕ) или цветообразующих единиц (ЦОЕ). Длительность проведения исследования, возможность ошибки при разведении образца, тенденция уреаплазм к агрегации, влияние сопутствующей микрофлоры или принимаемых препаратов на рост уреаплазм ограничивают точность метода и влияют на правильность оценки клинической значимости этого лабораторного маркера.
Важным недостатком культурального метода является невозможность дифференцировать виды Ureaplasma (U.parvum и U.urealyticum), т.к. в последнее время накоплено большое количество данных, свидетельствующих о разной степени патогенности этих двух видов. Так, доказано, что U.urealyticum может вызывать воспалительные заболевания, уретриты и цервициты, а U.parvum с высокой частотой обнаруживается в урогенитальном тракте здоровых женщин без жалоб и патологий. Частота обнаружения уреаплазм в группе здоровых беременных женщин возрастает до 70-80%, причем в большинстве случаев выявляется U.parvum в высоком титре.
Цель.
Целью нашей работы явилась разработка тест-системы для одновременной дифференциации двух видов уреаплазм – U.parvum и U.urealyticum и определения их концентрации в клинических образцах на основе ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени, а также апробация ее на контрольных образцах и клиническом материале в сравнении с микрокультуральным тестом «Уреаплазма Микротест», который успешно прошел испытания и получил разрешение для использования в медицинской практике в России.
Материалы и методы.
На основе мультипраймерной полимеразной цепной реакции в реальном времени нами была разработана тест-система «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT» для дифференциации и количественного определения ДНК двух видов уреаплазм - Ureaplasma parvum и Ureaplasma urealyticum. В качестве мишени для амплификации в геноме микроорганизма был выбран однокопийный ген уреазы, на который были выбраны три праймера для амплификации, один из них общий, узнающий ДНК обоих видов уреаплазм, два другие – дифференцирующие. Также были выбраны два флуоресцентно меченных зонда, один, меченный флуоресцентным красителем Fam, специфичный для U.parvum, другой, меченный красителем R6G, специфичный для U.urealyticum. В тесте также используется внутренний стандарт – количественно охарактеризованный неконкурентный внутренний контроль, который предназначен для стандартизации и учета эффективности всех этапов ПЦР-анализа и используется для расчета точной концентрации микроорганизма в объеме клинического образца. Для амплификации и выявления ВК выбраны праймеры и зонд, меченный флуорофором Rox.
Для расчета концентрации ДНК U.parvum и ДНК U.urealyticum в стандартном объеме клинического образца, в который помещен стандартный объем клинического материала, необходимо знать количество копий ДНК U.parvum, U.urealyticum и ВК в реакционной пробирке, а также количество копий ДНК ВК, добавленное в каждый исследуемый образец на этапе пробоподготовки. Первые три значения мы получаем из данных прибора, измеряющего количество единиц флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации и сравнивая их со значениями флуоресцентных сигналов в контролях-калибраторах, образцах, в которых находится ДНК U.parvum, U.urealyticum и ВК в известной нам концентрации. А концентрацию ДНК ВК в образце мы получаем из вкладыша в инструкцию к тест-системе, в котором вписаны результаты измерений данной серии контрольных образцов. Пользуясь формулой расчета концентрации и электронными таблицами Excel можно автоматически получить искомые значения для большого массива исследуемых образцов за несколько минут, всего лишь скопировав данные с прибора и вставив их в нужные колонки электронной таблицы. Принципиальным отличием от культурального исследования, результаты которого учитываются визуально, а поэтому высок риск ошибок, которые может допускать лаборант, в количественном ПЦР-тесте исходные данные и результаты исследования хранятся в лабораторной базе и всегда доступны.
Разработанная тест-система была апробирована на разведениях стандартных культур U.parvum (контрольный штамм 468-1) и U.urealyticum (контрольный штамм 2T-2), концентрация живых микроорганизмов в которых измерялась стандартным методом лимитирующих разведений. Аналитическая чувствительность теста составила 500 копий ДНК/мл для обоих штаммов. Диапазон линейного измерения составил – от 103 до 107 копий в мл. Результаты определения средней по 10 измерениям концентрации целевых микроорганизмов в контрольных штаммах представлены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты измерения ДНК уреаплазм в контрольных образцах культуральным методом и с помощью ПЦР в реальном времени.
|
Штамм (вид) |
Концентрация ДНК Ureaplasma(копий/мл) |
Титр U.p./U.u. (ЦОЕ/мл) |
|
468-1 (U.parvum) |
7.9*105 |
2.0*105 |
|
2T-2 (U.urealyticum) |
2.0*106 |
3.2*105 |
Концентрация уреаплазм в культуральной жидкости U.parvum и U.urealyticum по данным культурального теста ниже концентрации по уреаплазм по данным ПЦР-теста в 4 и 6 раз ниже, соответственно. Это связано с тем, что в культуральном тесте, в отличие от ПЦР, выявляются только жизнеспособные микроорганизмы. А в любом микробиологическом сообществе, в данном случае, чистой культуре микроорганизмов, находящейся в конце логарифмической фазы роста, одновременно существуют как жизнеспособные, так и нежизнеспособные микроорганизмы, которые не выявляются бактериологическими методами. Таким образом, по нашим данным, в исследуемой культуре U.parvum доля жизнеспособных клеток составляет 25% от всей массы уреаплазм, а в культуре U.urealyticum она составляет 16%.
Воспроизводимость результатов количественных измерений изучали на образцах вагинального отделяемого при тестировании нескольких аликвот из одного и того же образца (на семи образцах, содержащих U.parvum в концентрации от 8*104 до 5*106 копий/мл). А также нескольких последовательных получений вагинального отделяемого из разных зон задненижнего свода влагалища от одной и той же пациентки (материал забранный от двух пациенток содержал U.parvum в концентрации 1.3*106 и 7.6*105 копий/мл). В первом случае коэффициент вариации (CV) находился в пределах от 4,2% до 13,1%, что свидетельствует о высокой точности метода измерения. Во втором случае он составил 14.3 и 34.1%, соответственно, разница логарифмов концентраций не была более 0.4, и это означает, что степень обсемененности уреаплазмами вагинального эпителия одинакова, независимо от зоны.
Для апробации новой тест-системы на клиническом материале в сравнении с культуральным тестом были собраны образцы цервикального канала и отделяемого влагалища от женщин, обратившихся к гинекологу по поводу заболеваний шейки матки или беременных женщин, проходящих плановый осмотр. Образцы собирали в стерильную транспортную среду для культурального теста и затем тестировали на наличие уреаплазм культуральным тестом и с помощью ПЦР-теста «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT». Всего было протестировано 81 образцов. Результаты выявления уреаплазм обоими методами представлены в таблице 2. В таблице 3 представлены значения концентраций ДНК уреаплазм в образцах, давших отрицательный результат в культуральном тесте. Данные по распределению видов уреаплазм в группе ПЦР-положительных образцов представлены в таблице 4. Данные по соотношению значений концентраций уреаплазм, полученных в культуральном тесте и с помощью количественного ПЦР-теста представлены в таблице 5.
Таблица 2. Результаты выявления U.parvum и U.urealyticum в клинических образцах.
|
|
«Уреаплазма Микротест» положительный |
«Уреаплазма Микротест» отрицательный |
|
«АмплиСенс U.p./U.u.–титр-FRT» положительный |
43 |
8 |
|
«АмплиСенс U.p./U.u.-титр-FRT» отрицательный |
0 |
30 |
Таблица 3. Результаты определения концентрации U.parvum и U.urealyticum в клинических образцах, давших отрицательный результат в культуральном тесте.
|
образец |
Вид Ureaplasma |
Копий ДНК/мл |
lg копий ДНК/мл |
|
18 |
U.parvum |
8.2*104 |
4.9 |
|
19 |
U.parvum |
9.1*105 |
5.0 |
|
20 |
U.urealyticum |
7.6*102 |
2.9 |
|
73 |
U.parvum |
9.2*105 |
6.0 |
|
76 |
U.parvum |
1.8*104 |
4.3 |
|
104 |
U.parvum |
2.0*103 |
3.3 |
|
106 |
U.urealyticum |
4.4*104 |
4.6 |
|
116 |
U.parvum |
8.2*102 |
2.9 |
Таблица 4. Распределение видов уреаплазм в группе ПЦР-положительных образцов.
|
Вид Ureaplasma |
Количество образцов |
% от общего числа положительных |
Средняя концентрация (lg копий/мл) |
|
U.parvum |
37 |
72,5 |
5.4 (2.3 – 6.7) |
|
U.urealyticum |
12 |
23,5 |
5.3 (2.9 – 7.0) |
|
U.parvum+ U.urealyticum |
2 |
3,9 |
5.8, 5,9 |
Таблица 5. Значения концентраций уреаплазм, полученные в культуральном тесте и с помощью количественного ПЦР-теста.
|
Титр уреаплазм по данным культурального теста |
Образцов в группе |
Среднее и разброс значений концентрации ДНК уреаплазм в ПЦР-тесте (lg копий ДНК/мл) |
|
106 |
16 |
6.1 (4.6 – 6.0) |
|
105 |
11 |
5.3 (3.5 – 6.4) |
|
104 |
4 |
6.2 (6.1 – 6.2) |
|
103 |
12 |
5.1 (3.8 – 6.0) |
Как видно из данных, представленных в таблицах 2 и 3, чувствительность ПЦР-теста в выявлении уреаплазм выше чувствительности культурального теста, причем, в культуральном тесте не выявлялись положительные образцы, концентрация уреаплазм в которых была достаточно высокой, более104 уреаплазм в мл клинического образца.
Как видно из таблицы 4, образцы, содержащие U.urealyticum составляют примерно четверть от всех положительных образцов, причем концентрация уреаплазм в образце не зависит от ее вида.
Из данных, представленных в таблице 5 следует, что точность определения титра уреаплазм основанного на десятикратных разведениях образца и определения положительного результата с помощью культурального метода значительно уступает точности определения концентрации уреаплазм с помощью количественного ПЦР-теста. Коэффициент корреляции между двумя методами составил 0,43.
Заключение.
Таким образом, тест-система «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT», разработанная для дифференциации видов уреаплазм и определения концентрации ДНК уреаплазм в образцах из урогенитального тракта, показала лучшие аналитические характеристики в сравнении с культуральным тестом «Уреаплазма Микротест» и может быть рекомендована для использования в рутинной лабораторной практике.