Разработка и клиническая апробация тест-системы «Амплисенс HCV-1/2/3»

Разработка и клиническая апробация тест-системы «Амплисенс HCV-1/2/3»

Введение

Вирусный гепатит С – инфекционное заболевание с парентеральным механизмом передачи, характеризующееся тяжелым поражением печени. Возбудитель – вирус гепатита С (ВГС), принадлежащий семейству Flaviviridae. Гепатит, обусловленный ВГС, отличается высокой частотой хронизации инфекционного процесса, приводящей у части больных к развитию цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы.

Популяция ВГС отличается высокой степенью гетерогенности. Описано 6 генотипов ВГС (обозначаются арабскими цифрами: 1-6), каждый из которых подразделяется на субтипы (обозначаются строчными буквами латинского алфавита). Номенклатура обозначения генотипов и субтипов ВГС, в совокупности с данными о географическом распределении вариантов ВГС, представлена в международной базе данных нуклеотидных последовательностей ВГС Национальной лаборатории Лос-Аламоса (Los Alamos National Laboratory; http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/HTML/ToolsOutline.html). Описанные субтипы ВГС и субтипы, выявленные на территории Российской Федерации показаны в таблице.

Генотипы	Субтипы	Субтипы, выявленные на территории Российской Федерации
1	a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m	1a, 1b
2	a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r	2a, 2c, 2k
3	a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l	3a
4	a, b, c, d, e, f, g, h, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t	4а
5	a	–
6	a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s	–

Согласно информации, указанной в базе данных, на территории Российской Федерации выявлены 1, 2, 3 и 4 генотипы ВГС, генотип 4 ВГС встречается крайне редко (единичные завозные случаи из стран Северной Африки). Генотипы 5 и 6 на территории России не обнаружены. Изучение ВГС-положительных образцов, поступающих в Центр молекулярной диагностики (ФГУН Центрального НИИ эпидемиологии), свидетельствует о том, что наиболее часто выявляются субтипы 1b и 3a ВГС, на долю которых приходится более 85% всех поступающих ВГС-положительных проб. Реже встречаются субтипы генотипа 2, субтип 1a и пробы, содержащие несколько генотипов ВГС: 8,2%; 3,6% и 1,7%, соответственно (по результатам генотипирования 14252 ВГС-положительных образцов, выделенных в 2001-2004 гг.). В период с 2001 по 2007 г. было выявлено всего 15 образцов, содержащих генотип 4 ВГС, что составляет менее 0,05% всех генотипированных проб за этот период времени. Эти данные согласуются с опубликованными результатами отечественных исследователей, согласно которым, для территории Российской Федерации типична циркуляция субтипов 1a, 1b, 2a и 3a; причем наиболее часто выявляются ВГС субтипа 1b [1, 2].

Генотипирование ВГС, т.е. определение принадлежности ВГС к тому или иному генотипу (субтипу), направлено на решение эпидемиологических и клинических задач. Эпидемиологические задачи включают в себя генетическую характеристику вирусов, циркулирующих на определенной территории, отслеживание путей передачи и выявление закономерностей распределения ВГС в популяции. Для решения этих задач важное значение принимает не только идентификация генотипа ВГС, но и более детальное исследование, направленное на определение субтипа (субтипирование) в рамках генотипа ВГС.

Результаты многочисленных исследований, свидетельствуют о том, что определение генотипа ВГС имеет не только эпидемиологическое, но и клиническое значение. Согласно современным представлениям, отраженным в материалах ряда консенсус-конференций, в том числе, в последнем международном консенсусе Национального института Здоровья США, пациенты, инфицированные ВГС 1-го генотипа, хуже отвечают на противовирусное лечение препаратами интерферонов, чем пациенты, инфицированные ВГС 2 или 3 генотипа [3]. В связи с этим, пациентам, инфицированным  ВГС с 1 генотипом, рекомендовано более длительное лечение, чем пациентам со 2-м или 3-м генотипом ВГС. Включая определение генотипа ВГС в алгоритм лабораторного обследования с целью выбора эффективной схемы лечения, ряд авторов считает достаточным дифференцировать случаи инфицирования генотипом 1 («genotype 1») от случаев инфицирования другими генотипами («genotype non-1»), не проводя при этом не только детализацию на уровне субтипов вируса, но и не уточняя к какому генотипу – 2-му или 3-му они принадлежат [4].

В связи с этим, предлагаемая разработка, позволяющая выявлять и дифференцировать ВГС на уровне генотипов 1, 2, 3, направлена на решение клинической задачи – выбора адекватной схемы лечения пациентов с хроническим вирусным гепатитом С препаратами интерферонов.

Целью настоящего исследования стала разработка ПЦР-тест-системы с гибридизационно-флуоресцентной детекцией для определения 1, 2 и 3 генотипов ВГС в плазме ВГС-положительных пациентов.

Результаты

На основании нуклеотидных последовательностей ВГС, представленных в GenBank, проведен анализ фрагментов генома ВГС. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей генома ВГС позволило заключить, что оптимальным  локусом для дизайна праймеров и флуоресцентно-меченых зондов является фрагмент 5’-нетранслируемой области (5’UTR). Выбранный фрагмент 5’-нетранслируемой области позволил подобрать праймеры, специфичные для всех генотипов ВГС, и зонды, специфичные к генотипам 1, 2 и 3 ВГС; длинна амплифицируемого фрагмента – 208 п.о.

Для дифференциации генотипов и детекции специфического флуоресцентного сигнала выбрано три зонда: зонд «G1» (меченый флуорофором «FAM») – для выявления ВГС 1 генотипа, зонд «G2» (меченый «R6G») – для ВГС 2 генотипа; зонд «G3» (меченый «ROX») – для ВГС 3 генотипа. На контрольных образцах с высокой вирусной нагрузкой различных генотипов ВГС (порядка 10⁷-10⁸ МЕ/мл) была проверена специфичность выбранных зондов к соответствующим генотипам. Показано, что зонд «G1» не дает перекрестных реакций со 2 и 3 генотипом ВГС. Для зондов «G2» и «G3» также показана специфичность в отношении 2 и 3 генотипов ВГС, соответственно. Все выбранные зонды не имели перекрестных реакций с генотипом 4 ВГС.

Разработка тест-системы проводилась в двух форматах: с детекцией результатов амплификации в режиме «реального времени» и с детекцией «по конечной точке». С помощью стандартных контрольных образцов была определена аналитическая чувствительность тест-системы «АмплиСенс HCV-1/2/3». Для варианта тест-системы с детекцией результатов ОТ-ПЦР в режиме «реального времени» аналитическая чувствительность составила 500 МЕ/мл, при анализе результатов амплификации «по конечной точке» – 1000 МЕ/мл.

Пробоподготовка образцов плазмы ВГС-положительных пациентов проводится с помощью комплекта для выделения РНК «РИБО-сорб» (ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии). Для исключения ложноотрицательных результатов при выделении РНК необходимо использовать внутренний контрольный образец (ВКО). В качестве ВКО в тест-системе «АмплиСенс HCV-1/2/3» используется бактериофаг, содержащий рекомбинантную РНК. Зонд для детекции ВКО помечен флуорофором «Cy5». Для контроля качества постановки ПЦР-реакции тест-система «АмплиСенс HCV-1/2/3» включает положительные контрольные образцы (ПКО) для каждого генотипа (ПКО1, ПКО2, ПКО3). Препараты ПКО для генотипов 1, 2 и 3 ВГС представляют собой плазмиду, содержащую фрагмент кДНК ВГС соответствующего генотипа.

Выбор одной универсальной пары праймеров и генотип-специфических зондов для детекции 1, 2 и 3 генотипов позволил оптимизировать формат тест-системы: для определения генотипа ВГС в клиническом образце достаточно проведение одной ОТ-ПЦР-реакции. Были оптимизированы условия проведения обратной транскрипции РНК ВГС и последующей амплификации кДНК. Обе реакции проводятся последовательно в одной пробирке («one-step») без предварительного этапа получения кДНК, что снижает риск контаминации и упрощает процедуру проведения анализа.

Проведен анализ 78 ВСГ-положительных клинических изолятов с известной вирусной нагрузкой. Вирусная нагрузка определялась с помощью тест-системы «АмплиСенс HCV-Монитор-FRT» (регистрационное удостоверение №ФСР2007/00577 от 09 октября 2007 г.). Вирусная нагрузка находилась в диапазоне от 10² до 10⁷ МЕ/мл; подавляющее большинство образцов (59) имело вирусную нагрузку 10⁵–10⁶ МЕ/мл. У всех клинических изолятов был определен генотип с помощью референс-метода – тест-системы с электрофоретической детекцией результатов ПЦР «АмплиСенс HCV-генотип» (регистрационное удостоверение №ФС01032006/5189-06 от 29 декабря 2006 г.) [1]. В ходе тестирования ВГС-положительных изолятов дискордантных результатов получено не было.

Для варианта тест-системы «АмплиСенс HCV-1/2/3» в режиме «реального времени» параметры проведения ОТ-ПЦР адаптированы для следующих приборов с четырьмя каналами детекции флуоресцентного сигнала: «RotorGene3000», «RotorGene6000» (Corbett Research, Австралия), «iQ5» (Bio-Rad, США) и «SmartCyclerII» (Cepheid, США). Анализ результатов амплификации «по конечной точке» проводится после проведения ОТ-ПЦР на флуориметре «ALA1» (Biosan, Латвия). Параметры проведения амплификации адаптированы для приборов «Терцик» (ДНК-Технология, Россия), «PalmCycler» (Corbett Research, Австралия) и «GeneAmp3700» (Applied Biosystems, США).

Пример тестирования ВГС-положительных клинических проб на тест-системе «АмплиСенс HCV-1/2/3» в режиме «реального времени» (амплификация и детекция результатов – на приборе «RotorGene3000»):

Пример тестирования ВГС-положительных клинических проб на тест-системе «АмплиСенс HCV-1/2/3», детекция результатов «по конечной точке» (амплификация на приборе «Терцик», детекция результатов – «ALA1»):

Столбец «FAM/фон» – детекция 1 генотипа ВГС и ПКО 1 (I), cтолбец «HEX/фон» – детекция 2 генотипа ВГС и ПКО 2 (II), cтолбец «ROX/фон» – детекция 3 генотипа ВГС и ПКО 3 (III), «ОКО» – отрицательный контроль выделения РНК, «RT-буфер» – отрицательный контроль ОТ-ПЦР. Клинические пробы – образцы 1-10; положительные пробы отмечены знаком «+».

Заключение

Разработана тест-система «АмплиСенс HCV-1/2/3» на основе гибридизационно-флуоресцентной детекции «в реальном времени» и «по конечной точке» для выявления и дифференциации генотипов 1, 2, 3 ВГС, циркулирующих на территории Российской федерации. Тест-система обладает аналитической чувствительностью 500 МЕ/мл при детекции результатов амплификации в режиме «реального времени» и 1000 МЕ/мл в формате детекции «по конечной точке». Специфичность тест-системы позволяет исключить перекрестные реакции между указанными генотипами, а также с ВГС редкого для России 4-го генотипа. Полученные на основе использования тест-системы результаты позволяют выбрать соответствующую схему лечения интерфероновыми препаратами.

Литература

1. Гущин А.Е., Носкова О.М., Шипулин Г.А. Разработка набора реагентов "Амплисенс HCV-генотип" для определения субтипов 1а, 1b, 2а, 3а вируса гепатита С. Вопр. вирусол. – 2003. т. 48, №3: 45-48.
2. Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Миширо С. и др. Закономерности распространения вируса гепатита С и его генотипов в России и странах СНГ. Вопр. вирусол. – 1997. №4: 157-161.
3. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: Management of hepatitis C: 2002--June 10-12, 2002. Hepatology. – 2002 (Suppl 1): S3-20.
4. Harris H.E., Eldridge K.P., Harbour S., et al. Does the clinical outcome of hepatitis C infection vary with the infecting hepatitis C virus type? J. Viral. Hepat. – 2007. 14(3): 213-20.