Разработка набора реагентов на основе ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК парвовируса В19 и его апробация на контрольной панели QCMD и клиническом материале

Разработка набора реагентов на основе ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК парвовируса В19 и его апробация на контрольной панели QCMD и клиническом материале

Парвовирус В19 является возбудителем инфекционных заболеваний, в более половины случаев протекающих бессимптомно, а в большинстве остальных случаев – в виде неспецифических респираторных заболеваний. Инфекционная эритема, также известная как «пятая болезнь» или «болезнь отшлепанных щек» – частое заболевание у детей от 4 до 11 лет, клинический диагноз которого ставится, обычно, после появления общего недомогания и сыпи, а также эритемы на щеках. Эритемные парвовирусные заболевания широко распространены в мире и часто встречаются, но в связи с недостатком лабораторных тестов часто диагностируются как краснуха (тем более, что эти два заболевания имеют одинаковую сезонность), аллергия или просто «вирусная инфекция». Особую опасность заражение парвовирусом В19 представляет для беременных женщин, первичное инфицирование которых повышает опасность для здоровья и жизни плода, а также для реципиентов донорской крови. Инфицирование вирусом через донорскую кровь или ее продукты приводит к апластическому кризу, хронической персистентной анемии, острой или хронической полиартропатии (2).

Парвовирус В19 в острой фазе может присутствовать в крови в очень высокой концентрации – до 1012 ГЭ/мл. Так при пулировании сотен-тысяч плазм от различных доноров для промышленного изготовления факторов коагуляции и других продуктов достаточно одного положительного образца для заражения всего объема. Кроме того, парвовирус В19 может длительно (до года) сохраняться в крови в отсутствие каких-либо клинических симптомов (3, 4). В мировой практике ПЦР является обязательным этапом тестирования донорской крови. В процессе подготовки донорская кровь и плазма проходят процедуры очистки от факторов инфекции. Очистка материала от парвовируса В19 связано с определенными сложностями, обусловленными маленькими размерами и отсутствием липидной оболочки у вирусных частиц, а также их устойчивостью к химической дезактивации растворимыми дезинфицирующими средствами (1). Поэтому существует острая необходимость тестирования донорской крови на наличие ДНК парвовируса.

Цель

Разработка высокочувствительного набора реагентов для выявления ДНК парвовируса В19 на основе ПЦР в режиме реального времени и его апробация на контрольной панели QCMD.

Материалы и методы

1. панель контрольных образцов плазмы QCMD, содержащих ДНК парвовируса В19 в различных концентрациях; 
2. образцы разных видов клинического материала от больных с экзантемными проявлениями и симптоматическими признаками краснухи, а также от беременных женщин с нарушениями нормального развития плода.

Для определения В19 IgG и В19 IgM антител методом иммунофлуоресцентного анализа использовался единый диагностический набор Biotrin Inc., Dublin, Ireland. Для выявления ДНК парвовируса В19 использовался набор реагентов «АмплиСенс вариант FRT Parvovirus B19» с гибридизационно–флюоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме реального времени для качественного выявления ДНК парвовируса В19 в различном клиническом материале разработан ПЦР, разработанный во ФГУН “ЦНИИЭ” Роспотребнадзора. Праймеры и флуоресцентно-меченный зонд были выбраны в области гена структурного белка VP1, а также использовался неконкурентный внутренний контроль, который вносили в образец на этапе пробоподготовки для оценки эффективности всех этапов ПЦР исследования: выделения ДНК, амплификации, качества измерения флюоресцентного сигнала прибором. В качестве экзогенного неконкурентного внутреннего контроля использовался искусственно сконструированный фрагмент ДНК, клонированного в ДНК фаг-λ. В качестве положительного контроля в наборе используется клонированный фрагмента гена, кодирующего структурный белок VP1 парвовируса В19, полученный из клинического изолята парвовируса B19. Полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» проводилась с использованием прибора «Rotor Gene 3000/6000» (Corbett Research, Австралия).

Результаты

Для определения аналитической чувствительности ПЦР набора реагентов «АмплиСенс вариант FRT Parvovirus B19» использовали серию 10–кратных и 2–кратных разведений КР ДНК Parvovirus B19 – Real–time с концентрацией 5х109 ГЭ/мл. Аналитическая чувствительность теста составила 400 ГЭ/мл.

Апробация на контрольной панели QCMD

Апробация набора реагентов в качественном и количественном вариантах проводилась на панели контрольных образцов плазмы, содержащих парвовирус В19 в различных концентрациях, полученной нами в международной организации контроля качества ПЦР-исследований QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics, Scotland) в 2006 году. Для осуществления количественной оценки результатов амплификации к набору были добавлены три калибровочных стандартных образца с определенными концентрациями ДНК Parvovirus B19 (измерение концентрации калибраторов проводили при помощи тест-системы «CQS-Bla-System»).

Всего в данной программе QCMD принимали участие 58 организаций из 21 страны. При помощи нашего набора панель была расшифрована на 100%. Количественная оценка полученных результатов показала меньший разброс значений в концентрациях предложенных образцов, по сравнению с результатами другой представленной в отчете QCMD лаборатории. В точках с наибольшей нагрузкой ДНК парвовируса В19 (более 104 МЕ/мл) точность метода составила 100%. В трех образцах, концентрация ДНК парвовируса В19 в которых составляла менее 104 МЕ/мл (соответствует 10 копиям ДНК в образце), разброс составлял 20-50%. По результатам статистики, собираемой в QCMD, основная проблема большинства коммерческих тест-систем – это получение ложноположительных результатов. Обе отрицательные плазмы, заложенные в контрольной панели, при помощи нашего набора были определены как негативные (100%).

Апробация на клиническом материале

Оценка аналитической специфичности набора реагентов «АмплиСенс вариант FRT Parvovirus B19» проводилась на двух контрольных группах образцов периферической крови (плазма и клетки), слюны и мазков из зева: отрицательная – от 23 здоровых людей, негативных по результатам ИФА анализа на антитела классов IgG и IgM, и положительная – от 8 пациентов с установленным диагнозом «острая парвовирусная инфекция» по результатам клинического наблюдения и ИФА анализа на антитела классов IgG и IgM. Во всех пробах от 23 здоровых человек был получен валидный сигнал внутреннего контроля и не выявлялся сигнал ДНК парвовируса В19. Во всех образцах положительной контрольной группы выявлялся высокий уровень сигнала ДНК парвовируса В19: в плазме значения Ct находились в пределах от 28,65 до 22,61 (соответствует значениям от 103 до 1,6*105 ГЭ/мл), в клетках крови – от 25,2 до 16,8 (соответствует значениям от 104 до 2*107 ГЭ/мл), в слюне – от 33,29 до 21,9 (соответствует значениям от 1 до 2*105 ГЭ/мл), в мазках – от 34,3 до 20,9 (соответствует значениям от 1 до 8*105 ГЭ/мл). В дальнейшем планируется разработка количественной тест-системы на базе нынешнего набора реагентов путем введения калибровочных стандартных положительных контролей.

Выводы

Разработан ПЦР набор реагентов «АмплиСенс вариант FRT Parvovirus B19» с гибридизационно–флюоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме реального времени с экзогенным неконкурентным внутренним контролем, позволяющим контролировать все процессы ПЦР анализа от этапа выделения ДНК из клинического образца до учета результатов. ПЦР-тест был апробирован на панели контрольных образцов плазмы QCMD, содержащих парвовирус В19 в различных концентрациях, и была показана высокая аналитическая чувствительность и специфичность разработанного набора. Аналитическая чувствительность составила 400 ГЭ/мл, аналитическая специфичность разработанного теста – 100%, что показывает возможность использования последнего для проведения медицинских анализов с целью постановки и уточнения диагноза, дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний, для наблюдения развития болезни и определения длительности персистенции парвовируса В19 в различном клиническом материале, а также в качестве контроля эффективности назначаемого лечения.

Список литературы

1. Тейтел Дж. Защита концентратов факторов коагуляции от вирусной инфекции // Facts and Figures, 1997, № 004.
2. Brown K.E., Young N.S. Parvoviruses and Bone Marrow Failure // Stem Cells, 1996, №14, 151-163.
3. Heegaard E.D., Brown K.E. Human Parvovirus B19 // Clinical Microbiology Reviews, 2002, Vol. 15, No. 3, p. 485–505
4. Neal S. Young, M.D., and Kevin E. Brown, M.D. Parvovirus B19 // The New England Journal of Medicine, 2004, No. 350, pp.586-97.