Разработка панели контрольных образцов ДНК вирусов папилломы человека, ее валидация и тестирование в ВПЧ-тестах «Амплисенс»

Разработка панели контрольных образцов ДНК вирусов папилломы человека, ее валидация и тестирование в ВПЧ-тестах «Амплисенс»

В течение последнего десятилетия наблюдается широкое  внедрение в российскую лабораторную практику методик и коммерческих тест-систем для выявления и генотипирования ДНК вирусов папилломы человека (ВПЧ). Все эти методики и тесты предназначаются для решения самых разных клинических и эпидемиологических задач и реализуются на основе самых разных технологий. Это приводит к тому, что тесты для выявления ДНК ВПЧ значительно отличаются друг от друга по чувствительности и спектру выявляемых генотипов, что неизбежно увеличивает количество несовпадающих результатов между лабораториями, использующими разные тесты. И, в конечном итоге, создает путаницу в представлениях врачей и пациентов.

Наиболее важная проблема, для разрешения которой необходимо и оправдано использование ВПЧ-тестов – скрининг предраковых заболеваний шейки матки. Наиболее часто используемые для этой цели технологии – гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР), обладают разной аналитической чувствительностью и специфичностью. Спектр выявляемых типов ВПЧ варьирует от двух (16 и 18) до всех типов аногенитальной группы α, включающей как типы высокого канцерогенного риска, так и типы низкого и невыясненного канцерогенного риска. Причем, многие из тест-систем российского производства уже получили регистрационные удостоверения, разрешающие их применение в медицинской практике на территории РФ.

Сложившаяся ситуация вызывает необходимость в создании панелей контрольных образцов ДНК ВПЧ для контроля качества производимых реагентов и тест-систем, а также их внедрения в службу внешнего контроля качества выполнения исследований на наличие ДНК ВПЧ. Следует заметить, что проблема отсутствия стандартизованных контрольных образцов ДНК ВПЧ касается не только российской лабораторной службы. В наиболее известных международных системах контроля качества (VQC, QCMD), имеющих контрольные панели для выявления самых разных вирусов, отсутствуют панели, содержащие ДНК ВПЧ.

Цель настоящей работы – разработка панели контрольных образцов, содержащих полные геномы ДНК ВПЧ различных генотипов в разных концентрациях для оценки аналитической чувствительности и специфичности ВПЧ-тестов, предназначенных для скрининга.

Материалы и методы

Получение рекомбинантных плазмид, содержащих полные геномы ВПЧ.

Предварительный анализ литературы показал, что наиболее часто используемые в качестве мишеней участки генома ВПЧ – гены E6, E7, E1, E2, L1 – которые составляют наибольшую часть генома вируса. Поэтому мы решили клонировать максимально протяженные участки генома ВПЧ, содержащие последовательности всех этих генов. Мишень для клонирования получали с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров для каждого типа ВПЧ. В качестве матрицы использовали ДНК экстрагированные и очищенные из клинических образцов, содержащих ДНК ВПЧ искомого типа в высокой концентрации. Таким образом, нами были клонированы ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59 типов высокого канцерогенного риска и ДНК  ВПЧ типов низкого (6, 11) и невыясненного (53, 66, 73) канцерогенного риска.

 Приготовление растворов контрольных ДНК ВПЧ

Очищенные из клеток E.coli плазмидные ДНК рестрицировали и  разводили в ДНК-буфере (ТЕ-буфер, содержащий очищенную ДНК плаценты человека в качестве балласта). Затем измеряли концентрацию разведенных ДНК и готовили разведения с заданной концентрацией. Для разведения использовали отрицательный контроль (NC) из тест-системы «Digene», который представляет собой транспортную среду с добавлением балластной ДНК, имитирующей ДНК клеток человека, необходимой для адекватного проведения теста на основе гибридизации.  

ДНК, содержащие геномы ВПЧ типов высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56 и 58 типов) разводили до концентраций 10³, 10⁴,10⁵ и10⁶ копий/мл и использовали для оценки чувствительности тест-систем, а ДНК, содержащие ВПЧ типов низкого канцерогенно риска (6, 11, 53, 66, 73) разводили до концентрации 10⁷ копий/мл и использовали для оценки специфичности тест-систем.

Кроме растворов перечисленных рекомбинантных плазмид нами использовались также контрольные образцы из тест-системы «Hybrid Capture 2 High Risk HPV DNA Test» фирмы «Digene» (США) и образцы из тренировочной панели «HC2 Training Panel» («Digene», США) содержащие клонированные в плазмиде фрагменты генов E6E7L1 ДНК ВПЧ 16 типа в различных концентрациях. В тест-системе используются два положительных контроля. Первый, калибровочный, HRC (содержит ДНК ВПЧ 16 типа в концентрации 1 pg/ml), используется для нормализации сигнала в образцах. Второй, Quality Control HR (содержит ДНК ВПЧ 16 типа в концентрации 5 pg/ml), используется для контроля качества выполнения теста. Образец А из тренировочной панели (содержит ДНК ВПЧ 16 типа в концентрации 10 pg/ml). Концентрацию ДНК ВПЧ в этих образцах мы также измерили  методом лимитирующих разведений.

Измерение концентрации ДНК ВПЧ в образцах.

Концентрацию рекомбинантных ДНК измеряли методом лимитирующих разведений, используя в качестве мишени ген β-лактамазы, который содержит плазмидный вектор, используемый для клонирования генома ВПЧ. Каждый образец измеряли не менее трех раз и рассчитывали среднее значение по трем измерениям.

Тестирование полученных контрольных образцов в различных ВПЧ-тестах.

Для тестирования контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ различных генотипов использовали следующие тест-системы:

- «Hybrid Capture 2 High Risk HPV DNA Test» (HC2) фирмы «Digene» (США), которая позволяет выявлять ДНК ВПЧ 13-ти типов высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68) в концентрации не менее 10⁵ копий/мл,

- «АмплиСенс ВПЧ-скрин EP» (AC-EP), которая позволяет выявлять ДНК ВПЧ 14-ти типов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 70) в концентрации не менее 5*10³ копий/мл,

 - «АмплиСенс ВПЧ-скрин FEP» (AC-FEP), которая позволяет выявлять ДНК ВПЧ 11-ти типов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67) в концентрации не менее 5*10³  копий/мл,

- «АмплиСенс ВПЧ-скрин-титр FRT» (AC-FRT), которая позволяет выявлять и определять концентрацию ДНК ВПЧ 12-ти типов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) в концентрации не менее 5*10³ копий/мл,

 

Результаты

При измерении концентрации ДНК в контрольных образцах тест-системы и тренировочной панели «Digene» нами были получены результаты, представленные в таблице 1. При измерении концентрации ДНК в образцах панели контрольных образцов «АмплиСенс» нами были получены результаты, представленные в таблице 2. Результаты тестирования контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ 16, 1, 52, 18, 39, 45 типов и их разведений представлены в таблице 3. Результаты тестирования контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ 6, 11, 53, 66 и 73 типов представлены в таблице 4.

Таблица 1. Результаты измерений концентрации ДНК в контрольных образцах «Digene».

Название образца.	Тип ВПЧ	Количество измерений	Среднее значение (копий/мл) и стандартное отклонение
HRC (пол. контроль, 1 pg/ml)	16	5	1.1*105 ± 7.3*103
QC-HR (5 pg/ml)	16	5	5.1*105 ± 9.9*104
TP A   (10 pg/ml)	16	5	1.2*106 ± 1.1*105

 

Таблица 2. Результаты измерений концентрации ДНК в контрольных образцах панели «АмплиСенс» и образцах, содержащих ДНК ВПЧ низкого канцерогенного риска.

Название образца.	Тип ВПЧ	Количество измерений	Среднее значение (копий/мл)
QP-16-1	16	3	1.6*106
QP-18-1	18	3	9.3*105
QP-31-1	31	3	2.0*106
QP-33-1	33	3	5.5*106
QP-39-1	39	3	2.9*106
QP-45-1	45	3	4.4*106
QP-51-1	51	3	2.1*106
QP-52-1	52	3	2.8*106
QP-56-1	56	3	2.4*106
QP-58-1	58	3	5.9*106
QP-59-1	59	3	2.7*106
HPV 6	6	3	2.1*107
HPV11	11	3	1.9*107
HPV 53	53	3	1.6*107
HPV 66	66	3	2.2*107
HPV 73	73	3	3.1*107

 

Таблица 3. Результаты тестирования контрольных образцов ДНК ВПЧ высокого риска и их разведений в ВПЧ-тестах «АмплиСенс» (EP, FEP, FRT) и «HC2 HPV DNA test».

 

Таблица 4. Результаты тестирования  контрольных образцов ДНК ВПЧ низкого и неустановленного канцерогенного риска в ВПЧ-тестах «АмплиСенс» (AC-EP, AC-FEP, AC-FRT) и «Digene» (HC2).

 

Обсуждение

Из данных представленных в таблице 2 видно, что пороговая чувствительность тест-системы «HC2 HPV DNA test», которая задается с помощью контроля-калибратора HRC (1 pg/ml), составляет 10⁵ копий ДНК ВПЧ/мл, однако, данные, представленные в таблице 3 показывают, что при тестировании контрольных образцов «АмплиСенс» аналитическая чувствительность теста HCII выше и варьирует в зависимости от типа ВПЧ, составляя  1.6*10⁴ копий ДНК/мл для ВПЧ 16 и 9.4*10⁴ копий ДНК/мл для ВПЧ 18.  Причина этого явления, возможно, заключается в том, что в контрольной ДНК из тест-системы «HC2 HPV DNA test», присутствует не весь геном ВПЧ 16 типа, а только короткий участок генома, содержащий гены E6E7L1. РНК-зонды, которые рассчитаны на гибридизацию по всей длине генома ВПЧ, остаются неизрасходованными, что приводит к снижению сигнала теста в положительном контроле. В контроле «АмплиСенс» клонирован почти весь геном ВПЧ 16 типа, поэтому сигнал теста в нем, всегда будет выше, чем в контроле-калибраторе PC, при равной концентрации их ДНК. Таким образом, аналитическая чувствительность теста «HC2 HPV DNA test» выше, чем 10⁵ копий ДНК ВПЧ/мл и составляет, в зависимости от типа ВПЧ от 10⁴до 10⁵ копий ДНК/мл.

Данные, представленные в таблице 3, позволяют оценить специфичность ВПЧ-тестов по их способности не выявлять ДНК ВПЧ низкого онкогенного риска. Все рассматриваемые ВПЧ-тесты не выявляют ДНК ВПЧ 6, 11 и 73 типов. Однако, тесты, основанные на гибридизации и ПЦР с группоспецифическими праймерами в варианте с электрофоретической детекцией, не способны отличать типы ВПЧ, принадлежащие к одной филогенетической группе – ДНК ВПЧ 53 и 66 типов выявляется в тестах «Hybrid Capture 2 HR HPV DNA Test» и «АмплиСенс ВПЧ-скрин EP», что может приводить к снижению диагностической специфичности этих тестов.

 

Выводы

Разработана панель контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ наиболее важных типов высокого канцерогенного риска. Образцы количественно охарактеризованы и приготовлены в разных концентрациях для оценки аналитической чувствительности ВПЧ-тестов. Панель валидирована с помощью ВПЧ-теста «Hybrid Capture 2 HR HPV DNA Test» (который был одобрен FDA в 2003 году, а затем, после проведения широких испытаний в разных странах мира, рекомендован для скрининга) и может быть использована для валидации российских ВПЧ-тестов и контроля качества проведения ВПЧ-тестирования.