Разработка тест-систем на основе мультиплексной ПЦР для обнаружения эпидемически значимых холерных вибрионов

Разработка тест-систем на основе мультиплексной ПЦР для обнаружения эпидемически значимых холерных вибрионов

Введение

Факт широкого распространения холерных вибрионов в окружающей среде должен обращать на себя внимание эпидемиологов и способствовать организации мониторинга за эпидемическим потенциалом циркулирующих холерных вибрионов. Для быстрой оценки эпидемической ситуации целесообразно применение новых методов индикации, позволяющих одновременно обнаружить микроорганизм и охарактеризовать его значимость (определить наличие маркеров патогенности и серогруппу). Оптимальным решением этой задачи является применение мультилокусной ПЦР.

Цель

Разработка ПЦР тест-систем для проведения экспресс-анализа на присутствие возбудителей холеры с их одновременной характеристикой по признакам эпидемической значимости.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы из коллекций КПЧС и из Государственной коллекции патогенных бактерий (РосНИПЧИ «Микроб»). ПЦР проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Москва), ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводили на амплификаторах Rotor Gene 3000 (Corbett Research, Австралия), для детекции флуоресценции после окончания амплификации использовали прибор Ala-1 (Biosan, Латвия).

Результаты

В ФГУН ЦНИИЭ совместно с КПЧС разработана тест-система «АмплиСенс V.cholerae» для выявления ДНК V. cholerae всех серогрупп (по наличию последовательности Hly) и идентификации патогенных штаммов Vibrio cholerae (по наличию основных факторов вирулентности – ctxA, tcpA) и доказательства принадлежности к серогруппе О1 (по наличию амплификации мишени wbeT) или к серогруппе О139 (по наличию амплификации мишени wbeF) в воде открытых водоемов, а также в фекалиях с помощью ПЦР с детекцией методом электрофореза. Постановка реакции осуществляется в мультиплексном формате с использованием «горячего старта» в двух пробирках: «Скрин» - амплификация мишеней ctxA (554 п.н.), tcpA (ElTor и Classica) – (202 п.н.) и внутреннего контрольного образца (ВКО) (751 п.н.) и «Тип» - амплификация мишеней Hly (517 п.н.) и  wbeT (204 п.н.) и wbeF (345 п.н.) и ВКО (770 п.н.).

Аналитическая специфичность тест-системы доказана при тестировании близкородственных микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры и ряда других возбудителей кишечных инфекций: Salmonella еnteritidis, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumonia, Listeria monocytogenes, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Morganella morganii, Enterobacter faecalis, Escherichia coli, Aeromonas, Plesiomonas shidel, Commomonas, а также вибрионов других видов (18 шт. из коллекции КПЧС) – V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.anguillarum, V.mimicus, V.splendidus, V.fluvialis, V.proteolyticus и на 50 образцах фекалий людей с энтеритами различной бактериальной и вирусной этиологии. Ложноположительные, либо неспецифичные реакции не были зарегистрированы.

Аналитическая чувствительность тест-системы определялась при тестировании референтных штаммов -  Р-1, КМ-569, 10588 и 17 полевых изолятов V.cholerae O1 серогруппы, выделенных в 1991, 1994 и 1999 годах и 15  полевых изолятов V.cholerae других серогрупп, выделенных в 2000, 2001 и 2002 годах (из коллекции КПЧС) и на образцах ДНК, охарактеризованных количественно методом лимитирующих разведений ДНК, и составила 100%, и в количественном выражении -  1000 геномных эквивалентов в 1 мл тестируемого образца. Разработанная тест-система используется для проведения мониторинга открытых водоемов и сточных вод городских очистных сооружений автономной республики Крым (Укриана).

В ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора совместно с РосНИПЧИ «Микроб» разработана аналогичная тест-система с гибридизационно-флуоресцентной детекцией фрагментов ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-ФРВ) и после окончания амплификации – по конечной точке (ПЦР-ФКТ). Постановка реакции проводится в мультиплексном формате в двух пробирках: «Скрин» – амплификация мишеней ctxA (FAM), tcpA (ElTor) – (ROX) и ВКО (JOE) и «Тип» – амплификация мишеней Hly (JOE) - холерные вибрионы всех серогрупп, wbeT (FAM) – принадлежность к серогруппе О1, WbeF (ROX) – принадлежность к серогруппе О139. В эту тест-систему входят праймеры, использованные в тест-системе «АмплиСенс V. cholerae».

Тест-система апробирована на референтных штаммах V.cholerae -  Р-1, КМ-569, 10588, КМ 26, М045 и изолятах, выделенных от больных в 1965 г. (Узбекистан), 1970 г. (Астрахань), 1991 г. (Украина), 1994 г. (Дагестан) и 2004 г. (Белозерск) из Государственной коллекции патогенных бактерий (РосНИПЧИ «Микроб»). Аналитическая специфичность была доказана при тестировании гетерологичных микроорганизмов других родов: Salmonella, Shigella, Campylobacter, Klebsiella, Listeria, Proteus, Pseudomanas, Staphilococcus, Morganella morganii, Enterobacter, E.coli, Aeromonas, Plesiomonas, а также вибрионов других видов – V.paragemoliticus, V.alginolyticus, V.anguillarum, V.mimicus, V.splendidus, V.fluvialis, V.proteoliticus, а также на 100 образцах фекалий людей без энтеритов и 50 образцов фекалий людей с энтеритами различной бактериальной и вирусной этиологии. Ложно-положительные, либо неспецифичные результаты не были зарегистрированы.

Отсутствие перекрестной реакции при определении принадлежности к серогруппе О1 и О139 доказано при тестировании штаммов  V.cholerae из Государственной коллекции патогенных бактерий (РосНИПЧИ «Микроб»), относящихся к  66 различным серогруппам: O2-O9, O11-O14, O16-O33, O35, O36, O39-O63, O65-O69, O71, O73-О75, O77, O79-O82. Чувствительность анализа в мультиплексном формате по каждой из тестируемых мишеней составила 10 микробных клеток  в ПЦР, специфичность – 100%.

Заключение

Внедрение данных тест-систем в практику здравоохранения позволит оптимизировать эпидемиологический надзор за холерой за счёт значительного снижения времени и трудоемкости исследования.