Разработка тест-системы для скринингового выявления 11 генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска в формате клинически значимого количества, основанной на ПЦР с детекцией флуоресцентного сигнала по конечной точке (FEP)

Разработка тест-системы для скринингового выявления 11 генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска в формате клинически значимого количества, основанной на ПЦР с детекцией флуоресцентного сигнала по конечной точке (FEP)

По данным Международного агентства по изучению рака ВОЗ рак шейки матки (РШМ) одно из наиболее распространённых онкологических заболеваний, занимающее второе место по частоте встречаемости среди женщин во всём мире, уступая только раку молочной железы. Ежегодно в мире диагностируется около 500 тысяч случаев заболеваний, и 250 тысяч пациентов умирают.

В ходе многочисленных исследований была установлена этиологическая роль вирусов папилломы человека (ВПЧ) типов высокого канцерогенного риска (ВКР) в развитии предраковых поражений и РШМ. На сегодняшний день охарактеризовано 15 генотипов  ВПЧ высокого канцерогенного риска: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 - с которыми связано 95,3% случаев заболеваний РШМ. В клинической практике очень важна ранняя диагностика заболевания.

Одним из первых и основных методов диагностики предраковых поражений стал цитологический анализ мазка. Однако он является субъективным методом и зависит от квалификации врача. Поэтому программы цитологического скрининга не сумели существенно уменьшить частоту развития  РШМ. Международным агентством по изучению рака ВОЗ рекомендовано включение в программы популяционного скрининга молекулярные тесты для выявления ВПЧ.

В России диагностика ВПЧ-инфекции преимущественно основывается на применении ПЦР с электрофоретической детекцией. Этот подход связан с высоким риском контаминации помещения и получения ложноположительных результатов. Контаминационно безопасной и недорогой методикой является качественная ПЦР с флюоресцентной детекцией продуктов амплификации после окончания реакции, без открывания пробирок.

Согласно недавним исследованиям, важное значение для прогноза течения ВПЧ-инфекции имеет вирусная нагрузка. Выявление вируса в количестве не ниже определенного порогового уровня (порога клинической значимости), имеет малое клиническое значение, так как говорит о высокой вероятности спонтанного излечения и практически полном отсутствии риска прогрессии. Считается, что для целей скрининга данный порог обязателен к использованию: положительными учитываются только случаи вирусной нагрузки превышающей порог.  Для послеоперационного мониторинга, выявление вируса даже с низкой нагрузкой может быть ранним маркером рецидива, потому введение порога в этом случае не оправдано. Ранее нами была проведена работа по созданию количественной методики определения нагрузки ВПЧ на основе ПЦР в реальном времени, и был определен согласующийся с данными литературы пороговый уровень клинически значимого количества вируса – 3lg (10^3) г.э. ВПЧ приходящиеся на 10^5 клеток.

До настоящего времени предлагаемые тесты, основанные на флуоресцентной детекции, качественно выявляли только 16 и 18 типы ВПЧ ВКР с которыми ассоциировано не более 71,5% случаев возникновения РШМ, или дорогостоящие количественные тесты на основе ПЦР в реальном времени.

Нашей целью стала  разработка методики выявления широкого спектра генотипов ВПЧ, ассоциированных более чем с 93%  случаев РШМ, использующую  принцип детекции флуоресценции по конечной точке. А так же создание стандартизированной методики взятия материала и пробоподготовки, которая позволит использовать качественный ВПЧ-тест в формате выявления только клинически значимых инфицирований вирусом.

Цели исследования

1. Разработка системы олигонуклеотидов (праймеров и зондов), позволяющие амплифицировать и осуществлять детекцию специфических геномных участков 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67 типов ВПЧ, а так же β-глобинового гена человека в качестве эндогенного внутреннего контроля (контроль за взятием, транспортировкой, хранением образца, выделением ДНК и проведением ПЦР).
2. Определение аналитической чувствительности и специфичности разработанной методики.
3. Сравнение с альтернативными методами выявления ВПЧ.
4. Разработка  стандартизированной методики взятия материала и пробоподготовки для использования качественного ВПЧ-теста в формате выявления только клинически значимой вирусной нагрузки.
5. Определение диагностической чувствительности разработанной методики.

Материалы и методы исследования

1. Для дизайна олигонуклеотидных последовательностей использовался пакет программ Vector NTI 9 (InforMax Inc., 2003), а так же был разработан математический алгоритм поиска консервативных фрагментов последовательностей в пределах группы для последующего выбора группоспецифичных олигонуклеотидов. 
2. Для оценки аналитической чувствительности и специфичности использовались плазмидные контроли ВПЧ высокого канцерогенного риска: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67 (разработанные в ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора); ВПЧ кожных типов: 1, 3, 4, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 27, 37, 38, 49, 50, 65 (любезно предоставленные докторами M. Favre и E.M.de Villiers).
3. Сравнение разработанной методики выявления ВПЧ проводилось с «nested»-ПЦР с использованием рекомендованных для выявления ДНК ВПЧ международных праймерных систем MY11/MY09 и GP5+-GP6+ праймерами MY11/09, GP5+/6+ выявляющими как ВПЧ ВКР, так и низкого канцерогенного риска (НКР), и рекомендуемой FDA для использования в клинико-лабораторной практике тест-системой «Hybrid Capture II HPV test» (Digene) выявляющей ВПЧ ВКР.
4. Оценка диагностической чувствительности была проведена на 87 клинических образцах с цитологическими признаками тяжёлой дисплазии (H-SIL) и гистологически подтверждёнными ЦИН3 или РШМ. Диагностическая чувствительность и специфичность оценивались на 214 клинических образцах цитологической нормы (без цитологических признаков цервикальных интраэпителиальных неоплазий).

Результаты и обсуждение

1. С учётом дизайна олигонуклеатидов, был проведён подбор условий амплификации выбранных геномных участков в мультиплексной ПЦР. В результате олигонуклеотиды были объединены в 2 смеси с детекцией сигнала по двум флуоресцентным каналам. Первая смесь включает в себя детекцию 31, 35, 39, 59 типов ВПЧ ВКР по одному каналу, и 16 тип ВПЧ, как наиболее онкогенный, по другому каналу. Вторая смесь выявляет 18, 33, 45, 52, 58, 67 типы ВПЧ по одному каналу, и β-глобиновый ген человека по второму каналу. Для флуоресцентных детекторов, имеющих 3 и более каналов флуоресцентной детекции, олигонуклеотиды были модифицированы для выявления всех перечисленных генотипов ВПЧ в одной пробирке по трём каналам, включая - β-глобиновый ген человека (в качестве эндогенного внутреннего контроля).
2. Аналитическая чувствительность метода оценивалась с использованием 10-ти кратных разведений контрольных ДНК соответствующих типов, и составила 5*102 г.э. /мл для всех типов ВПЧ. Аналитическая специфичность метода оценивалась с использованием плазмидных контролей ВПЧ кожных типов, ВПЧ НКР (низкого канцерогенного риска), а так же с использованием плазмидных контролей различных микроорганизмов: Аденовируса типов 2, 3, 7, Цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр, вируса ветряной оспы, вируса гепатита В, С, вируса иммунодефицита человека первого типа, вируса герпеса человека типов 6, 8, вируса простого герпеса, Chlamydia trahomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureoplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus в  концентрациях 108  г.э./мл, в ходе исследования перекрёстных реакций обнаружено не было.
3. Аналитическая чувствительность амплификационной части разработанной методики сравнивалась с альтернативными методами выявления ДНК ВПЧ – c универсальными консенсусными праймерами MY09/11, GP5+/6+ и Hybrid Capture II (hc2) ВПЧ тестом (Digene). Сравнение проводилось на контрольной панели ДНК ВПЧ ВКР с последовательными 10-кратными разведениями ДНК 8 генотипов ВПЧ ВКР в ТЕ-буфере. В результате сравнения трёх методов выявления ДНК ВПЧ было получено, что Hybrid Capture II (hc2) ВПЧ тест (Digene) имеет чувствительность 105 г.э./мл для всех типов ВПЧ (что соответствует порогу клинически значимого количества вируса). Выявление ДНК ВПЧ универсальными праймерами MY09/11, GP5+/6+ сильно зависело от типа ВПЧ: 10^3 г.э./мл было только для 16, 33 и 45 типов, для 18, 31 и 59 типов – 10^4 г.э./мл, для 52 типа – 10^5 г.э./мл, чувствительность выявления 39 типа наиболее низкая – 10^6 г.э./мл. Вариация чувствительности может быть связана с наличием вырожденных нуклеотидов для некоторых типов ВПЧ в последовательности универсальных праймеров, в том числе и для 39 типа. Разработанная тест-система имеет одинаково высокую чувствительность выявления 10^3 г.э./мл для каждого типа ВПЧ ВКР.
4. Ввиду того, что hc2 ВПЧ тест (Digene) позволяет выявлять, согласно данным литературы, только клинически значимое количество вируса, а разработанный нами тест имеет превосходящую чувствительность, мы провели попытку создания такого алгоритма использования теста на принципе разведения образца, чтобы он выявлял только клинически значимое количество вируса. Для этого было необходимо, в первую очередь провести стандартизацию взятия материала и экстракции ДНК.
   Основным критерием выбора было 1) наличие достаточного количества материала после взятия и экстракции (оценивалось по количеству ДНК человека в специальной методике, основанной на количественной ПЦР в реальном времени; критерием служило наличие ДНК человека в концентрации не менее 5*10^4 г.э./мл) 2) минимальный разброс по количеству ДНК человека от образца к образцу (ввиду того, что при использовании качественных тестов не представляется возможным проведение нормализации на количество геномов человека, разрабатываемая методика должна давать максимально близкий выход ДНК человека). В ходе испытаний была подобрана следующая схема: взятие материала осуществляется цервикальной цитологической щеткой в 500 мкл транспортной среды АмплиСенс с муколитиком (производство ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Щетка обламывается и сохраняется в транспортной среде до доставки в лабораторию. Далее осуществляется экстракция ДНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля («ДНК Сорб-АМ», производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора) согласно инструкции. Апробация подобной методики на 643 образцах показала, что экстрагируемое количество ДНК человека составляет 6,54 lg (+- 0,31 lg) или 3,47*10^6 -  7,08*10^6 г.э./мл, разброс является приемлемым.
5. Подобранная схема была использована для оценки алгоритма использования тест-системы для выявления клинически значимого количества вируса. Клинические образцы с установленным цитологическим и/или гистологическим диагнозом норма или реактивные изменения (214 образцов) и диагнозом тяжелая дисплазия (H-SIL) или рак шейки матки (РШМ) (87 образцов). Сбор образцов и экстракция ДНК проводилась по методике, описанной выше. Диагностическая чувствительность и специфичность сравнивались с тест-системой hc2 ВПЧ-тест (Digene). Т.к. чувствительность  hc2 ВПЧ-теста (Digene) для выявления клинически значимого количества вируса составляет 10^5 г.э./мл, а чувствительность разработанной тест-системы на 2 порядка выше - 10^3 г.э./мл, т.о. при разбавлении выделенной ДНК на 2 порядка, мы могли выровнять чувствительность для двух тест-систем. Далее осуществлялась постановка ПЦР с разведением ДНК на 2 порядка и без него.
   Без разведения ДНК ВПЧ выявлена в 98,9% случаев (86 из 87), при осуществлении разведения экстракта ДНК на 2 порядка (предположительно выявление только значимого количества вируса)  – так же в 98,9% (86 из 87). При попытке повысить пороговое значение (произвести разведение на 3 порядка) количество выявленных случаев H-SIL и РШМ снизилось и составило 92,0% (80 из 87). Таким образом диагностическая чувствительность составила 98,9% для исходной выделенной ДНК, так и при разведении на 2 порядка. При исследовании образцов нормы или реактивных изменений ДНК ВПЧ выявлена в 38,3% образцов (82 из 214) (специфичность 61,7%). Проведение разведения на 2 порядка   позволило отсечь 59,8% ВПЧ положительных образцов с диагнозом норма или реактивные (49 из 82) как содержащих незначимое количество вируса. Таким образом при использовании порога клинической значимости ДНК ВПЧ в образцах нормы или с реактивными изменениями (осуществление разведения экстракта ДНК на 2 порядка) выявляется в 15,4% (33 из 214) (специфичность 84,6%).

Выводы

Нами была разработана тест-система для выявления широкого спектра генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67), основанная на ПЦР с детекцией флуоресценции по конечной точке. Тест-система обладает высокой чувствительностью (98,9%) и высокой специфичностью (84,6% - в формате выявления клинически значимого количества вируса), что позволяет её использовать для проведения скринингового обследования женщин с целью выявления группы риска развития тяжёлых дисплазий и рака шейки матки. Кроме того, данная тест-система позволяет выявлять 16 тип ВПЧ как наиболее онкогенный тип высокого канцерогенного риска.

При обнаружении этого типа рядом зарубежных исследователей (Castle, 2005) рекомендовано изменение алгоритма скринингового обследования. Данная методика является достаточно простой для проведения исследования, контаминационно безопасной и не требует высокотехнологичного дорогостоящего оборудования. А так же была разработана методика, позволяющая использовать качественный ВПЧ-тест в сочетании с описанным методом взятия клинического материала и экстракции ДНК (ДНК-сорб-АМ) для выявления только клинически значимых инфицирований вирусом папилломы человека и доказана ее эффективность на клинически охарактеризованных образцах.

Следует особо подчеркнуть, что подобный результат не может быть перенесен без соответствующего клинического подтверждения на другие методы взятия клинического материала, экстракции ДНК и другие качественные ВПЧ-тесты ввиду возможных их отличий по количеству и разбросу при взятии материала, эффективности экстракции и аналитической чувствительности ПЦР-методик.

Дополнительным удобством является то, что разработанная схема не изменяет описанных производителем в инструкциях протоколов экстракции ДНК или постановки ПЦР. Добавлениями являются жесткие требования к взятию материала (использование цитологических щеток, транспортной седы с муколитиком,  сохранение щетки в образце до доставки в лабораторию) и этап разведения препарата ДНК после экстракции и перед ПЦР на 2 порядка (в 100 раз).