ВПЧ-тестирование: алгоритмы диагностики и требования к молекулярным тестам для выявления вирусов папилломы человека

ВПЧ-тестирование: алгоритмы диагностики и требования к молекулярным тестам для выявления вирусов папилломы человека

Вирусы папилломы человека (ВПЧ) являются широко распространенной и гетерогенной группой вирусов. ВПЧ имеют кольцевой ДНК содержащий геном размером порядка 8 тысяч пар оснований. Таксономически вирусы папилломы делятся на роды (обозначаются греческими буквами (a, b, g и т.д), виды (обозначаются арабскими цифрами и буквой рода, например a7, a9, b1 и др.), типы (обозначаются арабскими цифрами, например, 16, 18, 6, 11 и др.). Эпидемиологически выделяют «кожные», тропные к ороговевающему эпителию типы (в основном роды b и g) и слизистые или аногенитальные (тропные к слизистым оболочкам) типы вируса (род a). Среди последних выделяют подгруппы низкого (в основном виды a1, a8, a10) и высокого канцерогенного риска (виды a5, a6, a7, a9) по их способности или неспособности оказывать трансформирующее воздействие на клетки эпителия. Эпидемиологическими исследованиями последних лет показано, что к группе высокого риска принадлежат типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82. Типы 26, 53 и 66 относятся к категории предположительно высокого риска. К группе низкого риска принадлежат типы 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81. Остальные типы относятся к категории неустановленного риска и чаще всего не ассоциированы с развитием патологий.

Типы ВПЧ как высокого, так и низкого риска способны оказывать продуктивное воздействие на клетки эпителия, приводя к развитию классических проявлений папилломавирусной инфекции – остроконечных кондилом гениталий – и дисплазий легкой степени (L-SIL или CIN1). Типы высокого онкогенного риска отличает способность оказывать трансформирующее воздействие на эпителиоциты, приводя к развитию предрака (дисплазии средней и высокой степени тяжести, H-SIL или CIN2,3) и рака. Следует подчеркнуть, что развитие дисплазий не обязательно сопровождается появлением остроконечных кондилом.

Низкоонкогенные генотипы ВПЧ

Характерной особенностью инфекции является высокая доля спонтанных излечений в течение одного года от момента инфицирования без развития клинических проявлений инфекции (остроконечных кондилом). При этом латентная и субклиническая формы инфекции опасности не представляют. Это обуславливает особенности диагностики. Основным информативным диагностическим маркером папилломавирусной инфекции низкого риска является выявление остроконечных кондилом (клинической формы) при осмотре.

Молекулярно-биологические методы исследования (в том числе ПЦР) могут быть использованы для диагностики папилломавирусной инфекции низкого риска. При этом следует помнить, что данный метод позволяет выявлять не только клиническую, но субклиническую и латентную формы инфекции, выявление которых малоинформативно, так как:

• инфекция типами низкого риска имеет низкий онкогенный потенциал (относительно безопасна)
• раннее выявление инфекции (до появления клинических признаков) не оправдано, так как большинство инфицирований самостоятельно излечиваются, кроме того, отсутствует эффективная этиотропная терапия на латентной стадии инфекции.

Из этого следует, что при проведении плановых обследований и диспансеризаций выявление факта инфицирования типами низкого канцергенного риска в большинстве случаев не оправдано. Исключение представляет обследование беременных. При беременности или ее планировании выявление ВПЧ низкого онкогенного риска является основанием для настороженности по отношению к развитию папилломатоза гортани у ребенка. При этом попытка лечения латентной и субклинической инфекции беременной или родоразрешение методом кесарева сечения не являются правильной врачебной тактикой, так как не обладают должной эффективностью и целесообразностью. Оправданным считается лишь тщательное наблюдение за новорожденным.

Кроме того показаниями к проведению обследования на наличие низкоонкогенных типов ВПЧ являются:

• дифференциальная диагностика с типами высокого канцерогенного риска
• дифференциальная диагностика с другими инфекциями (например, атипичным течением герпес-вирусной инфекции).

Выявление 6 и 11 генотипов ВПЧ является достаточным для диагностики, так как с ними сопряжено более 90% клинических форм низкоонкогенной папилломавирусной инфекции. Оптимальным может считаться выявление 5 генотипов ВПЧ 6, 11, 42, 43, 44.

 

Высокоонкогенные генотипы ВПЧ

Основная опасность, которую несет инфицирование вирусами данной группы, является риск развития рака шейки матки. роль ВПЧ в развитии рака шейки матки на сегодняшний день доказана и подтверждена ВОЗ. Кроме того показана ассоциация высокоонкогенных ВПЧ с большей долей рака заднего прохода (около 90% случаев), около 40% всех случаев рака влагалища, вульвы, полового члена, 10-15% случаев рака ротовой полости и гортани.

Рак шейки матки (РШМ) – одна из наиболее распространенных онкологических патологий, занимающее второе место по частоте встречаемости среди женщин в мире. Всего в мире ежегодно регистрируется около 600 тыс. новых случаев РШМ и более 250 тыс. смертельных исходов. В случае предрака и рака ВПЧ выявляется почти в 100% случаев, выявление ВПЧ на стадии отсутствия дисплазии характеризуется минимум 300-кратным увеличением риска развития РШМ. При этом рак шейки матки (РШМ) является одной из немногих нозологических форм злокачественных новообразований, которые удовлетворяют всем требованиям для проведения популяционного скрининга. Характерно, что это заболевание имеет надежно распознаваемую преклиническую фазу, длительный период развития, существуют возможности для дальнейшей верификации диагноза и методы эффективного лечения. Длительное время существовал единственный скрининг-тест – цитологический анализ мазка. Появление ВПЧ-тестов позволило усовершенствовать систему скрининга, существенно повысив чувствительность выявления предрака и рака шейки матки.

 

Особенности папилломавирусной инфекции. Концепция ВПЧ-тестирования.

Инфекция вирусом папилломы человека имеет ряд важных особенностей, без учета которых использование ВПЧ-тестирования сопряжено с рядом трудностей в трактовке результатов.

С одной стороны:

• При инфицировании большинство женщин (около 80%) излечиваются от ВПЧ в течение 9-15 месяцев от момента заражения без проведения лечебных процедур
• Инфекция приводит к развитию предрака у малой части инфицированных женщин (около 0,5%)
• От заражения до развития предрака и РШМ в среднем проходит 20 лет
• Отсутствуют эффективные методы лечения на стадии латентной инфекции (нет изменений в цитологической и/или кольпоскопической картине, но выявляется вирус).

С другой стороны:

• ВПЧ является основной причиной рака шейки матки
• Инфицированные женщины имеют в 300 раз более высокий риск развития рака.
• Инфекция является коварной и довольно часто не вызывает никаких жалоб у пациента и не выявляется при осмотре до перехода в стадию инвазивного рака.
• Клинические проявления папилломавирусной инфекции высокого риска может маскироваться другими заболеваниями уро-генитального тракта, что не позволяет во время выявить их с использованием традиционных методов.

Из перечисленных особенностей папилломавирусной инфекции следует, что положительный результат тестирования на наличие вируса должен трактоваться как

• принадлежность пациента к группе высокого риска по развитию рака шейки матки,
• потребность в дополнительных тщательных диагностических процедурах для выяснения текущей стадии инфекции и исключения тяжелой дисплазии и рака шейки матки (при этом диагностическая чувствительность по отношению в тяжелой дисплазии и РШМ у ВПЧ-тестирования существенно выше (93-99%), чем у цитологического анализа мазка (50-60%)
• необходимость в наблюдении за инфекцией при отсутствии клинических или субклинических проявлений.

Отрицательный результат тестирования трактуется как отсутствие риска развития тяжелой дисплазии и рака, при этом предсказательная ценность отрицательного ВПЧ-теста существенно выше, чем цитологического исследования.

 

ВПЧ-тестирование и другие методы выявления предраковой патологии.

Как ранее отмечалось, основной задачей диагностики папилломавирусной инфекции высокого канцерогенного риска является раннее выявление предраковых изменений. В настоящее время с этой целью используются цитологический, кольпоскопический, гистологический методы (выявляют наличие характерных для папилломавирусной инфекции изменений эпителия, дисплазий, рака). Молекулярно-биологические методы, позволяющие установить факт инфицирования и провести генотипирование ВПЧ, являются новыми методами и в связи с этим возникает вопрос об их необходимости и месте в структуре диагностики. Чтобы обосновать востребованность кратко остановимся на характеристике каждого из методов.

Цитологический анализ мазка – метод выявления морфологических изменений клеток, в том числе связанных с ВПЧ. Метод неспецифичен по отношению к инфекции вирусами высокого онкогенного риска и выявляет случаи легкой дисплазии, связанные с низкоонгкогенными ВПЧ. Качество результата в значительной мере зависит от квалификации врача-цитолога (тактовка субъективна) и от выбора способа окрашивания. Наиболее информативным методом окрашивания является метод Папаниколау, менее информативными – метод Паппенгейма и Лейшманн, не информативными (но наиболее используемыми в России) – по Романовскому-Гимза. Даже при проведении исследования с окраской по Папаниколау чувствительность цитологического анализа по отношению к тяжелой дисплазии и раку составляет в среднем 58% (вариация от 20% до 87%) при специфичности 90-97%. Низкой является предсказательная ценность отрицательного результата теста при наблюдении за пациентами в течение нескольких лет. В связи с этим рекомендуемые интервалы цитологических исследований в диспансеризации и скрининге составляют 1-3 года.

Кольпоскопия – метод является неспецифичным для папилломавирусной инфекции так как выявляет морфологические изменения эпителия in vivo. Являясь хорошим вторичным методом подтверждения цервикальной патологии, попытки использования кольпоскопии в качестве скринингового теста показали, что чувствительность исследования составляет порядка 75% при специфичности – 20%. Кроме того метод требует длительного времени, высокой квалификации врача-кольпоскописта, наличия специального оборудования в кабинете врача.

Гистологическое исследование – является золотым стандартом диагностики, однако не может быть методом скрининга в силу инвазивности и трудоемкости. Потому так же является вторичным методом диагностики

Выявление ВПЧ высокого риска молекулярными методами (ПЦР-диагностика) – не позволяют установить стадию инфекции, однако однозначно указывают на наличие или отсутствие инфекции. В связи с этим данная группа методов может использоваться только в совокупности с клиническими методами исследования. В то же время четкое определение принадлежности к группе риска с использованием молекулярных тестов позволяет сфокусировать внимание на отдельных пациентах и тем самым значительно повысить эффективность установления стадии инфекции клиническими методами. Опыт Европы и США показал, что совместное использование ВПЧ-тестирования и цитологии позволяют увеличить чувствительность выявления предрака и рака шейки матки до 96-99% и увеличить рекомендуемые интервалы между регулярными (скрининговыми) обследованиями до 5-7 лет. Последнее возможно так как у пациенток с отрицательным результатом ВПЧ-теста (включая группу с цитологическими L-SIL и ASC-US) в течение 5-7 лет не происходит развития тяжелой дисплазии.

Стратегии использования ВПЧ-тестов в диагностике предрака и рака шейки матки

1. Стратегия «скрининга и наблюдения»

Под данной стратегией понимают:

• Проведение скринингового обследования с целью выявления лиц из группы повышенного риска развития РШМ (инфицированных ВПЧ высокого канцерогенного риска). Данное обследование проводится вне зависимости от наличия жалоб или результата визуального осмотра врачом начиная с 25-30 лет каждые 3-5 лет.
• Более тщательная проверка выявленных лиц на наличие предраковой и раковой патологии с использованием инструментальных методов диагностики
• Своевременное лечения предраковой патологии
• Тщательное наблюдение за лицами из группы риска, но без признаков предраковой патологии.

Ведущими специалистами и рядом международных организаций (ASCCP, EUROGIN, ESIDOG и другие) предложены алгоритмы диагностики с использованием теста на ДНК ВПЧ:

• … как первичного скринингового метода в дополнение к цитологии для женщин старше 30 лет.
• … для разрешения сомнительных результатов цитологического исследования (ASCUS, ASC-H)
• … на первом этапе скрининга для стран, где плохо организованы программы цервикального цитологического скрининга

 

Алгоритм использования теста на ДНК ВПЧ совместно с цитологией на первом этапе скрининга

 

 

 

Алгоритм использования теста на ДНК ВПЧ для разрешения сомнительных результатов цитологичского исследования (ASCUS)

Алгоритм использования теста на ДНК ВПЧ как первичного метода скрининга с последующим цитологическим исследованием

 

2. Стратегия использования ВПЧ-теста в мониторинге терапии CIN2+

Под данной стратегией понимают проведение двойного исследования цитология+ВПЧ-тест через 6 месяцев после проведенного хирургического лечения и в случае получения двойного отрицательного результата считать пациентку полностью излеченной (в отличие от классической схемы, где для подтверждения статуса излеченности необходимо получение 4-5 отрицательных цитологических заключения)

 

Алгоритм использования теста на ДНК ВПЧ для мониторинга лечения CIN2+

 

Генотипирование ВПЧ

Дополнительные возможности определения прогноза течения заболевания может дать проведение генотипирования. Необходимость генотипирования может быть оправдана так как:

1. Выявление нескольких генотипов вируса ассоциировано с менее благоприятным прогнозом течения заболевания и более высоким риском персистенции.
2. Степень онкогенности различных генотипов высокого риска не одинакова. Наибольшей онкогенностью обладают 16 и 18 типы ВПЧ, существуют рекомендации по проведению определения этих двух генотипов вируса после теста на широкий спектр типов с целью более агрессивной тактики ведения пациентов: при выявлении 16 и 18 генотипов рекомендуется сразу проводить кольпоскопическое обследование, при выявлении других типов высокого риска – сначала проводить цитологию и только при положительном результате цитологии проводить кольпоскопию.
3. Проведение генотипирования позволяет отличить реинфицирование от персистентной инфекции при повторном визите пациента. Получать подобную информацию тем более важно, так как опасность представляет именно хроническая персистентная форма инфекции, недавнее же инфицирование наиболее вероятно спонтанно излечивается. О реинфицировании говорит изменение спектра генотипов, о персистентной инфекции – сохранение генотипа вируса через год после первого тестирования, повторное инфицирование тем же генотипом вируса после самостоятельного излечения практически невозможно.

 

Требования к тестам, используемым для выявления ДНК ВПЧ высокого риска

Для того, чтобы быть уверенным, что ВПЧ-тесты могут быть использованы в описанных алгоритмах диагностики, они должны удовлетворять ряду требований. На основании мирового опыта применения ВПЧ-тестирования эти требования были сформулированы. При проведении разработок тест-систем для ВПЧ-тестирования в ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора перечисленные мировые требования были взяты за основу и учтены:

 

• ВПЧ-тест должен выявлять только типы высокого канцерогенного риска;

Не следуя этому правилу и выявляя все генотипы ВПЧ, результат тестирования будет иметь крайне низкую диагностическую специфичность и информативность, так как подобные тесты, наряду с генотипами высокого канцерогенного риска, будут выявлять генотипы не ответственные за развитие предрака и РШМ и часто вообще не связанные с какой бы то ни было патологией урогенитального тракта. Тест-системы «АмплиСенс» производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора выявляют исключительно генотипы высокого канцерогенного риска

• ВПЧ-тест должен обнаруживать не менее десяти генотипов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59), что обеспечивает более чем 95%-ную диагностическую чувствительность теста;

Из эпидемиологических данных по распространенности различных генотипов ВПЧ высокого риска в РШМ следует, что выявление лишь 2 наиболее распространенных генотипов ВПЧ 16 и 18 будет обладать низкой диагностической чувствительностью (будет выявлено около 72% всех опухолей). Высокой диагностической чувствительностью будут обладать лишь тесты, выявляющие широкий спектр генотипов ВПЧ высокого риска. Выявление 10 наиболее распространенных генотипов ВПЧ позволяет выявлять 95%-99% всех случаев РШМ. Предназначенные для скрининга тест-системы «АмплиСенс» выявляют не менее 10 наиболее распространеных генотипов ВПЧ высокого риска.

• ВПЧ-тест должен иметь возможность выявлять только клинически значимую концентрацию вируса или дифференцировать клинически значимую от незначимой, что существенным образом сказывается на специфичности исследования

Основаниями для введения порога клинической значимости послужил ряд работ, указывающих на то, что вирусная нагрузка ниже определенного значения («порог значимости») не встречается в образцах тяжелой дисплазии и рака и ассоциирована с регрессией инфекции (клинически незначимое инфицирование). Нагрузка выше данного порога обозначается как клинически значимое инфицирование. Так же выделяется второй порог («порог прогрессии»). Вирусная нагрузка выше данного значения обозначается как повышенная и ассоциирована с большей вероятностью наличия или прогрессии в CIN2,3. На основании проведенных в ЦНИИ Эпидемиологии исследований и данных мировой литературы были определены и валидированы пороговые значения концентрации ВПЧ в образце: 3 логарифма (или 10³) геномов ВПЧ на 100 тыс. клеток человека - порог клинической значимости, 5 логарифмов ВПЧ на 100 тыс. клеток – порог прогрессии. В ходе валидации показано, что введение порога клинической значимости позволяет более чем на 20% повысить диагностическую специфичность исследования, при сохранении диагностической чувствительности. Скрининговые тест-системы «АмплиСенс», работающие по принципу ПЦР в реальном времени (FRT), позволяют выявлять точное количество вируса и нормировать его на количество попавших в образец клеток человека, что нивелирует вариации результата, связанные с неадекватным забором материала. Все расчеты проводятся автоматически. Для тест-систем, использующих принцип электрофоретической детекции или детекции конечной флуоресценции (FEP) разработан и валидирован на клиническом материале алгоритм выявления только клинически значимой концентрации вируса основанный на разведении образца.

 

• ВПЧ-тест должен быть клинически валидирован; должен обладать высокой чувствительностью выявления предраковых состояний (CIN2,3) и высокой специфичностью

Все тест-системы «АмплиСенс» для выявления ВПЧ высокого риска прошли валидацию на гистологически верифицированных клинических образцах с диагнозом В-ПИП/H-SIL и образцах от женщин без патологии шейки матки верифицированных как «норма» в двойных цитологических исследованиях. В ходе валидации были рассчитаны показатели диагностических чувствительности и специфичности по отношению к тяжелой дисплазии и РШМ (для тестов с введением порога клинической значимости).

 * в зависимости от  варианта ВПЧ-теста «АмплиСенс» чувствительность и специфичность незначительно варьирует

 

• ВПЧ-тест должен быть простым и быстрым в исполнении, недорогим, учет результатов должен быть автоматизирован;

Технологии флуоресцентной детекции по конечной точке и в реальном времени, используемые в тест-системах «АмплиСенс» (FEP и FRT) позволяют в значительной степени автоматизировать работу, минуя субъективный учет результатов электрофореграмм и получая результаты измерений непосредственно в компьютере.

 

 

 

Пациенты и вид клинического материала для исследования на ДНК вируса папилломы человека высокого риска

Исследование на ВПЧ проводят у женщин. Материалом для исследования служит соскоб цервикального канала и/или зоны трансформации, выполненный цервикальной цитологической щеточкой. Допускается взятие материала на цитологический и ВПЧ-тесты одной щеточкой: сначала делаются мазки-отпечатки, затем щеточка помещается в транспортную среду. При взятии материала щетку обламывают и сохраняют рабочую часть щетки в транспортной среде до доставки в лабораторию. Допускается использование универсального зонда для взятия материала из цервикального канала при невозможности использования цитологической щетки. Возможно исследование соскобов со слизистых половых органов, ротовой полости. Исследование вагинального содержимого или соскоба уретры менее информативно, чем цервикальных соскобов, потому практически не используется. Количественное исследование на ДНК ВПЧ валидировано и используется только для материала цервикального канала, при условии соблюдения всех правил взятия материала, сохранении щеточки в транспортной среде, использования сорбентных методов выделения ДНК (особенно актуально для полуколичественных методик на базе технологии детекции конечной флуоресценции FEP и электрофореза)

Исследование на ВПЧ у мужчин. Инфицированность мужчин ВПЧ сходна с инфицированностью женщин, но ввиду анатомических особенностей мужского уро-генитального тракта (отсутствие «зоны трансформации» эпителия) мужчины в большинстве случаев самостоятельно излечиваются или являются бессимптомными носителями инфекции.

С учетом того, что:

• опасность развития ассоциированной с ВПЧ онкологической патологии у мужчин не велика, а существующие формы рака не имеют 100% ассоциации с ВПЧ

• более 70% женщин к 25 годам столкнулись и переболели папилломавирусной инфекцией того или иного генотипа и не могут быть повторно инфицированы теми же генотипами, то есть доля воприимчивых к ВПЧ женщин относительно мала.

• инфицирование женщины не означает развитие клинических появлений инфекции так как высока вероятность самостоятельного излечения от вируса (около 80%)

проводить скрининговое выявление папилломавирусной инфекции у мужчин не следует. Исследование возможно лишь по эпидемиологическим показаниям и при проведении дифференциальной диагностики клинической формы папилломавирусной инфекции с другими инфекционными и неифекционными патологиями.

Следует помнить, что наличие ВПЧ у одного из партнеров при отсутствии ВПЧ у другого или несовпадение у партнеров спектра генотипов являются нормальным отражением биологии вируса и не могут говорить о супружеской неверности. Особенности биологии вируса, приводящие к несовпадению результатов:

• Вероятность инфицирования ВПЧ восприимчивого лица при однократном половом контакте – 80%, при двукратном – 99%

• вероятность полно самостоятельного излечения от ВПЧ в течение 9-15 месяцев – 80%

• обычно у одного их партнеров происходит более быстрая элиминация вируса или при инфицировании пары несколькими генотипами у партнеров может происходить элиминация разных типов, что связано с различной реактивностью макроорганизмов

• после самостоятельного излечения от ВПЧ определенного генотипа реинфицирование тем же генотипом не происходит.