Адаптированная к практическому применению методика [P]G генотипирования ротавирусов группы А

Адаптированная к практическому применению методика [P]G генотипирования ротавирусов группы А

Прогноз эффективности применения вакцин для профилактики тяжелого течения ротавирусной инфекции на той или иной территории невозможен без антигенной характеристики циркулирующих на ней штаммов ротавирусов гр А. Именно по этой причине [P]G типирование ротавирусов является обязательной частью программы ВОЗ по оценке бремени ротавирусных гастроэнтеритов.

В 1996 г была принята двойная система серотипирования ротавирусов гр А по белкам, кодируемым VP7(G) и VP4(P) сегментами их генома (Gentsch et al., 1996). По причине низкой эффективности моноклонального серотипирования (50-80% штаммов) большинство лабораторий используют методики типирования с применением типоспецифической RT-PCR (Gentsch et al., 1992).

Применение в данном протоколе двустадийной ПЦР с  электрофоретической детекцией продуктов амплификации требует больших трудозатрат, сопровождается высоким риском получения невалидных ложноположительных результатов исследования и может сопровождаться субъективностью их интерпретации, особенно при отсутствии соответствующих положительных контрольных образцов. Учитывая, что доступные данные по эффективности ротавирусных вакцин  касаются наиболее распространенных (G 1,2,3,4) типов ротавирусов, методика, описанная Gentsch et al., (1992) обладает избыточной информативностью для применения в рамках реализации вакцинальных программ.

Цель и задачи работы

Целью данной работы явилась разработка адаптированной к практическому применению методики [P] G типирования ротавирусов. Для достижения этой цели решались следующие задачи:

оценка разнообразия [P] G типов, циркулирующих на территории РФ штаммов ротавирусов грА с применением методик Gentsch et al., (1992) и определение их доминирующих типов.

разработка контаминационно-безопасной методики [P] G типирования ротавирусов гр А на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации

оценка валидности результатов, получаемых с применением разработанной методики в сравнении с методиками Gentsch et al., (1992) на клинических образцах.

Материалы и методы
 
Клинические образцы: Образцы фекалий, содержавшие ротавирусы гр А были получены от пациентов, госпитализированных с острыми кишечными инфекциями, на территории 9 городов РФ и стран СНГ в период с 01.01.2005 по 01.05.2007 (Москва, С-т Петербург, Махачкала, Элиста, Н Новгород, Тюмень, Челябинск, Якутск, Хабаровск).

Методики детекции и типирования ротавирусов: Для выявления ротавирусов использовались тест-системы «Амплисенс Ротавирус грА» и мультиплексная тест-система «Амплисенс ОКИ скрин» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.  [P]G типирование ротавирусов проводили с применением описанных в литературе  методик (Gouvea V, Glass R, Woods PA. et all., J Clin Microbiol 28: 276-282., Gentsch J., Glass R., Woods P. et all., J Clin Microbiol 30:1365-1373).

Создание генноинженерных положительных контролей: Для создания положительных контролей участки VP4 и VP7 сегментов генома ротавирусов гр А различных [P]G типов размером 890 и 950 п.н.о. соответственно были клонированы в вектор pGEM-T.

Результаты

На основе анализа 470 изолятов ротавирусов циркулирующих на территории РФ были выявлены их доминирующие  [P]G типы. В период с 2005 по 2007 год наблюдались годичные и территориальные различия в  распределении доминирующих [P]G типов ротавирусов. Суммируя данные по различным территориям можно отметить, что наибольшее распространение имели следующие типы ротавирусов: G4[P]8 (41.9%), G1[P]8 (32.9%),G2[P]4 (15.4%),G3[P]8 (7.26%).

Для создания методики мультиплексной типоспецифической RT-PCR с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации частично были использованы олигонуклеотиды предложенные Gentsch et al., для второго раунда амплификации. В разработанной методике с одностадийной амплификацией типоспецифичные олигонуклеотиды, описанные Gentsch et al., комбинировались с   оригинальными олигонуклеотидами (исключающих пересечения областей амплификации различных субтипов ротавирусов) и зондами в формате TaqMan beacons. Для детекции флуоресцентного сигнала использовали два канала (Fam и Hex (Joe)). В таком формате методика предусматривает дифференцировку наиболее распространенных G 1, 2, 3, 4 и [P] 4, 8 типов ротавирусов.

При сопоставлении результатов применения указанной методики с результатами, полученными на референтной методике (Gentsch et al., 1992) на панели, включавшей G 1, 2, 3, 4 и [P] 4, 8 типов ротавирусов (358 образцов) дискордантные результаты отсутствовали.  При использовании разработанного теста процент нетипируемых изолятов (по G либо по [P] типу) для различных территорий составил не более 7,6%.

Заключение

В ходе выполненной работы была разработана адаптированная к практическому использованию методика [P]G  типирования ротавирусов гр А и подтверждена высокая информативность ее применения на различных территориях РФ.