Эффективность применения ПЦР у больных ранними формами сифилиса

Эффективность применения ПЦР у больных ранними формами сифилиса

Введение

Прямые методы диагностики занимают важное место в диагностике сифилитической инфекции, в особенности в период «серологического окна» при первичном сифилисе. Наиболее перспективным из них является полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР - широко используемый метод, благодаря своим преимуществам имеет широкую перспективу внедрения в диагностику ИППП вообще и сифилиса в частности.

Чувствительность метода во многом зависит от клинического материала, подлежащего исследованию (кровь, спинномозговая жидкость, райц-серум сифилидов и др.), наибольшая чувствительность достигается при исследовании отделяемого сифилидов ввиду большей концентрации возбудителя в материале для исследования. Чувствительность и специфичность метода ПЦР при изучении райц-серума сифилидов при первичном сифилисе достигает 94,7% - 98,6%, при вторичном 80% - 98,6%. Корреляция результатов серологических тестов и ПЦР при ранних формах сифилиса достигает 95% (Orle K.A., 1996; Bruisten S.M., 2001; Palmer H.M., 2003; Leslieeslieeslieeslieeslie D.E., 2007).

Специфичность метода во многом обусловлена правильным выбором мишени для амплификации, при этом наиболее специфичными по данным литературы являются 47kDkDa, po1A гены ДНК и 16s рибосомальный ген РНК Т.pallidum. Выявляя в исследуемом материале фрагмент ДНК или РНК, характерный только для данного возбудителя, ПЦР-диагностикумы, в отличие от иммунологических тест-систем, исключают проблемы, связанные с перекрестно-реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную специфичность исследования.

Вместе с тем многие аспекты применения ПЦР при сифилисе остаются недостаточно изученными: до сих пор в России не проводилась сравнительная оценка чувствительности и специфичности ПЦР и классических методов прямой диагностики сифилиса (ТПМ), недостаточно изучена эффективность
применения метода при эпидемиологически значимых ранних формах сифилиса. Всё это делает данные направления работы чрезвычайно актуальными.

Цель работы

Целью настоящего исследования явилась клиническая оценка значимости использования полимеразной цепной реакции у пациентов с ранними формами сифилиса.

Материалы и методы исследования

На базе ГКБ №14 им. В.Г. Короленко и ряда кожно-венерологических диспансеров г. Москвы в период с января 2003 по февраль 2006 года был обследован 101 больной первичным и вторичным сифилисом. Диагноз первичного сифилиса был установлен у 19 человек (18,8%); диагноз вторичного
сифилиса - у 82 (81,2%) человек. Группу контроля составили 118 пациентов с высыпаниями несифилитической этиологии на гениталиях и в полости рта. Клиническим материалом для проведения ПЦР и темнопольной микроскопии служил райц-серум сифилидов, полученный с одних
и тех же высыпных элементов для исследования обоими методами.

Для выявления ДНК T. pallillillidum методом ПЦР использовался диагностикум «Амплисенс Treponema pallidum» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» (№ государственной регистрации ЛС-000916 от 18.11.2005г.). В качестве мишени для амплификации в данной тест-системе применен фрагмент гена поверхностного антигена бледной трепонемы - tpp47 (PCR tpp47), который отсутствует у других видов рода Treponema. В случае несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилось дополнительное тестирование образцов с помощью некоммерческой ПЦР-тест-системы, разработанной ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» с праймерами к 16S-рибосомальному гену микроорганизмов рода Treponema (PCR-16S-DNA).

Входящие в состав тест-системы олигонуклеотидные праймеры позволяли амплифицировать фрагмент ДНК не только бледной трепонемы, но и ДНК других видов трепонем. Для видовой идентификации выявленных микроорганизмов был использован метод секвенирования. В целях установления причин несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилась также дифференциация сифилитической и герпетической этиологии эрозивно-язвенных высыпаний в области гениталий. Для этого образцы райц-серума одновременно исследовались на предмет выявления ДНК вируса простого герпеса I и II типа (ВПГ-1 и ВПГ-2). Данное исследование осуществляли с помощью ПЦР-диагностикума «Амплисенс HSV1/2» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии
Роспотребнадзора».

Результаты

Совпадающие результаты обоих методов прямого выявления бледной трепонемы (ТПМ и ПЦР) были получены у 68 (67%) обследованных пациентов. У 28 пациентов (4 больных первичным и 24 - вторичным сифилисом) в райц-серуме сифилидов методом PCR-tpp47 обнаруживалась
ДНК бледной трепонемы, а темнопольная микроскопия давала отрицательный результат. У 5 больных ( 2 больных с диагнозом первичного и 3 – вторичного сифилиса) бледная трепонема выявлялась методом темнопольной микроскопии, а ПЦР давала отрицательный результат. Таким образом,
несовпадение результатов прямого выявления бледной трепонемы методами ТПМ и PCR-tpp47 было установлено у 33 пациентов (33%).

Для выяснения причин расхождения результатов между PCR-tpp47 и ТПМ и подтверждения обнаружения бледной трепонемы в исследуемом клиническом материале у 33 пациентов было проведено дополнительное исследование образцов на наличие 16S-рибосомального гена трепонем. Кроме этого, с целью видовой идентификации микроорганизма был проведен анализ нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов 16S-рибосомального гена методом секвенирования.

Таблица 1. Результаты проведения PCR-16SrDNA и секвенирования ДНК микроорганизмов в клинических образцах больных сифилисом с несовпадающими данными ТПМ и PCR-tpp47

Число образцов	PCR-tpp47	PCR-16SrDNA	Секвенирование
28	28	Обнаружена Treponema	Обнаружена T.pallidum
2	0	Обнаружена Treponema	Обнаружена T.putidum
3	0	Обнаружена Treponema	Обнаружена T.refringens

Как следует из приведенных данных, во всех клинических образцах, полученных от 28 больных сифилисом, было подтверждено наличие ДНК микроорганизмов рода Treponemа. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК обнаруженного микроорганизма, проведенный методом секвенирования, подтвердил его принадлежность к виду T.pallidum. Во всех 5-ти образцах пациентов, у которых метод ТПМ давал положительный результат, а результаты ПЦР-исследования оказались отрицательными, методом PCR-16S-rDNA было подтверждено наличие в клиническом материале трепонем. Вместе с тем метод секвенирования позволил отнести эти трепонемы к другим видам: T.putidum (у 2-х пациентов) и T.refringens (у 3-х обследованных), что говорило о возможности ошибок диагностики, допущенных врачами лабораторий при проведении темнопольной
микроскопии.

Эта группа была представлена двумя пациентами с диагнозом первичного сифилиса и тремя пациентами с диагнозом вторичного сифилиса. При этом, если у больных вторичным сифилисом клинические данные подтверждались результатами серологического обследования на сифилис,
то у пациентов с первичным сифилисом результаты как трепонемных, так и нетрепонемных серологических тестов были отрицательными, а диагноз был установлен только на основании клинических данных и положительных результатов ТПМ. Данные ПЦР и последующего секвенирования выделенных ДНК возбудителя подтвердили наличие в клинических образцах этих пациентов Treponema refringens, а не T.pallidum.

Кроме того, именно у этих двух пациентов из всех обследованных лиц в материале соскобов с высыпаний на коже была обнаружена ДНК вируса простого герпеса 2-го типа. Возможно, на фоне клинической картины, характерной для сифилиса, мнение специалиста, проводившего микроскопию, о видовой принадлежности наблюдаемых спирохет склонилось в пользу T.pallidum, в то время как причиной эрозивно-язвенных поражений гениталий являлся ВПГ-2. Полученные результаты позволяют считать, что этим пациентам с эрозивно-язвенными проявлениями, вызванными ВПГ-2 и колонизированными сапрофитными трепонемами, на основе результатов ТПМ диагноз первичного сифилиса был поставлен ошибочно, т.е. имела место гипердиагностика первичного сифилиса методом ТПМ.

С учетом результатов исследования окончательная оценка диагностической значимости полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции осуществлялась на 99 больных сифилисом. При этом чувствительность ПЦР у больных первичным сифилисом
составила 100%±0% (чувствительность темнопольной микроскопии – 76,5±10,6%, р<0,05), при вторичном сифилисе - 80,5±4,4% (темнопольной микроскопии – 51,2±5,6%, р<0,001). Общая чувствительность метода ПЦР при диагностике первичного и вторичного и вторичного сифилиса
составила 83,8±3,7% (темнопольной микроскопии – 55,6±3,0%, р<0,001). Общее количество случаев гипердиагностики методом ТПМ составило 5% (5человек из 101).

Изучение специфичности метода ПЦР при диагностике сифилиса, проведенное на 118 пациентах группы контроля, позволило подтвердить высокую специфичность метода. При этом результаты ПЦР оказались отрицательными у 116 пациентов и положительными – у 2-х женщин, у которых
клинический материал был получен из цервикального канала и на момент обследования отсутствовали клинические проявления сифилиса.

При динамическом наблюдении за данными пациентками была отмечена позитивация серологических реакций на сифилис и развились клинические признаки сифилиса. Возможно, в момент обследования клинические проявления инфекции у этих пациенток локализовались в области шейки матки и не были замечены при обследовании. Проведенные исследования позволили расценить специфичность метода ПЦР при обследовании на сифилис, как 100%.

Выводы

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать применение ПЦР на ранних стадиях сифилитической инфекции в качестве дополнения к общепринятым методам диагностики в следующих клинических ситуациях: при подозрении на первичный и вторичный сифилис,
в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической).