Эпидемиология. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности

------------------------------------

<*> ИСИЗ - изолирующие средства индивидуальной защиты (пневмокостюмы или их аналоги).

<**> РП - резиновые или латексные перчатки.

Приложение 4

БЕЗЗАРАЖИВАНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

1. Материал, подозрительный на зараженность бактериями I - II групп патогенности, не образующими споры.

1.1. К исследуемым образцам добавляют мертиолят натрия до концентрации 1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием их при 56 °С в течение 30 мин. После обработки мертиолятом натрия 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор на основе 6 М гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции к тест-системе, и инкубируют 15 мин. при 65 °С. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным.

1.2. Обеззараживание проб, подозрительных на зараженность возбудителем холеры: пробы исследуемого материала обеззараживают путем их прогревания при 100 °С в течение 30 мин.

2. Материал, подозрительный на зараженность бактериями, образующими споры (Bacillus anthracis).

Исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера, рН 7,2 +/- 0,1, и инкубируют с аэрацией при 37 °С в течение 2,5 ч. Добавляют пенициллин до конечной концентрации 1000 ед./мл и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин. Затем прогревают на водяной бане 10 мин. при температуре 100 °С, после чего 100 мкл обработанных, как описано выше, образцов переносят в пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор (по п. 1.1) и инкубируют 15 мин. при 65 °С.

Приложение 5

РЕЖИМЫ ДЕЗАКТИВАЦИИ ПРИ ПОСТАНОВКЕ ПЦР

1. Дезактивация буфера и гелей, содержащих бромид этидия

1.1. Первый способ

Необходимые реагенты для обработки 1 л буфера и гелей: 0,5 М перманганат калия - 1 л; 2,5 М соляная кислота - 1 л; 2,5 М NaOH - 1 л.

Порядок работы: отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4 - 6 ч. Добавляют 1 объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.

1.2. Второй способ

Необходимые реагенты: стеклянная колонка емкостью на 1 - 2 л; активированный уголь.

Порядок работы: заполнить колонку активированным углем и пропускать отработанный буфер через нее небольшими порциями. Дезактивированный раствор можно сливать в канализацию. Гели дезактивировать первым способом.

2. Дезактивация исследуемого материала и выделенных НК

2.1. При отсутствии проходного автоклава клинический материал, выделенные НК подвергают обеззараживанию в одноразовых пластиковых емкостях путем замачивания в дезинфицирующем растворе (режим обеззараживания согласно приложению 1 к СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)").

2.2. По истечении времени экспозиции дезинфицирующий раствор сливают, открытую емкость с обработанным материалом упаковывают в плотный термостойкий пакет и относят в автоклавную для последующего обеззараживания паром под давлением.

2.3. Проводят обеззараживание паром под давлением в следующем режиме: температура 132 +/-2 °С, давление 2,0 кГс/кв. см (0,2 МПа), время - 60 мин.

2.4. После обеззараживания паром под давлением пакет с инактивированным материалом выносят в контейнер для мусора с последующим вывозом на полигон бытовых отходов.

2.5. При наличии проходного автоклава клинический материал собирают в одноразовые термостойкие пластиковые емкости (либо термостойкие пакеты) и обеззараживают, как указано в п. 2.3.

3. Дезактивация пробирок с ампликонами, наконечников, перчаток

3.1. Пробирки с ампликонами, наконечники, перчатки, ветошь для обработки поверхностей в ПЦР-боксе после 1-го этапа амплификации (в случае выполнения двухэтапной ПЦР с вложенными праймерами) из зоны проведения ПЦР собирают в одноразовые пластиковые емкости и выносят в зону детекции результатов для последующей инактивации.

3.2. В зоне детекции результатов наконечники, пробирки с ампликонами (с предварительно открытыми крышками), перчатки, ветошь после окончания работы погружают на 1 ч в одноразовую пластиковую емкость, содержащую 5%-ный раствор хлорамина Б или 0,2%-ный раствор ДП-2Т.

3.3. По истечении времени экспозиции дезинфицирующий раствор сливают, открытую емкость с обработанным материалом помещают в плотный термостойкий пакет для последующего обеззараживания материала паром под давлением 2,0 кГс/кв. см (0,2 МПа) при температуре 132 +/- 2 °С в течение 60 мин.

3.4. После обеззараживания пакет с инактивированным материалом выносят в контейнер для мусора с последующим вывозом на полигон бытовых отходов.

4. Обработка рабочей одежды

4.1. Рабочую одежду сотрудников лаборатории маркируют индивидуально и в соответствии с зональным распределением, ее смену проводят не реже одного раза в неделю. В зоне детекции результатов желательно использовать одноразовую рабочую одежду, которую обрабатывают способом, описанным в разделе 3.

4.2. Стирку рабочей одежды сотрудников проводят в прачечной организации или в лаборатории. Не допускается одновременно производить стирку рабочей одежды разных зон.

4.3. Сдачу "грязной" и выдачу "чистой" рабочей одежды производят с соблюдением поточности и разделяют во времени.

4.4. Рабочую одежду сотрудников подвергают замачиванию в емкостях с дезинфицирующим раствором (0,1%-ный раствор ДП-2Т - в течение 60 - 120 мин., 0,5%-ный раствор хлорамина Б - в течение 30 мин.) при норме расхода средства 5 л на 1 кг сухого белья. Емкость закрывают крышкой. По окончании дезинфекции белье складывают в клеенчатые мешки. Стирку проводят со стиральным порошком при температуре 95 - 100 °С.

4.5. Защитные очки, сменную обувь сотрудников дезинфицируют 1%-ным раствором хлорамина Б или 0,2%-ным раствором ДП-2Т (2-кратное протирание). Остатки раствора удаляют ветошью, смоченной водой, и проводят обеззараживание ультрафиолетовым излучением влажных поверхностей в течение 1 ч.

Приложение 6

ДЕЙСТВИЯ ПРИ КОНТАМИНАЦИИ ЛАБОРАТОРИИ НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

1. Сотрудников, проводящих мероприятия по деконтаминации, обеспечивают одноразовыми халатами, шапочками, бахилами и перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления необходимых количеств моющих и дезинфицирующих растворов.

2. Каждую зону лаборатории обрабатывают сотрудники, работающие в ней.

3. Для обработки каждой зоны используют новый набор уборочного инвентаря.

4. Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки, например:

- участок 1 - бокс биологической безопасности и оборудование внутри него;

- участок 2 - внешние поверхности бокса биологической безопасности;

- участок 3 - шкафы для расходного материала;

- участок 4 - холодильники для хранения реактивов, образцов проб;

- участок 5 - оборудование, которое используют в работе, но стоит вне бокса биологической безопасности;

- участок 6 - поверхности помещения (стены, окна, батареи, потолок, двери и т.д.);

- участок 7 - пол.

5. Обработку проводят от участка к участку последовательно. Каждый участок обрабатывают отдельной ветошью. Перед обработкой персонал надевает одноразовую одежду, бахилы, шапочки, перчатки; готовит моющие и дезинфицирующие растворы.

6. Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой.

7. Затем на поверхность наносят на 30 мин. 0,2%-ный раствор ДП-2Т. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.

8. После завершения указанной обработки проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч.

9. Мероприятия, описанные в п. п. 7 и 8, повторяют еще раз.

10. Каждый последующий этап обработки проводят в новой одноразовой одежде (халат, шапочка, бахилы, перчатки) с использованием новой ветоши. Для удаления остатков нанесенных на поверхность дезинфицирующих средств ветошь тщательно прополаскивают в чистой воде, обрабатываемую поверхность протирают несколько раз. После каждого этапа обработки ветошь утилизируют.

11. По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие НК возбудителей инфекционных заболеваний, диагностика которых наиболее часто осуществляется в данной лаборатории, а также на выявление НК возбудителей, имеющих короткие - менее 300 п.н. - специфические продукты амплификации (длина специфического фрагмента указана в инструкциях к тест-системе).

12. Для проведения смывов стерильный зонд с ватным тампоном смачивают в ТЕ-буфере (10 мM Tris, 1 мM ЭДТА) и вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек, косяков, телефонов и т.п., особое внимание уделяя помещениям совместного посещения работников зоны детекции продуктов амплификации и других сотрудников лаборатории (столовая, санузел и т.п.). После взятия смыва зонд вращают в течение 10 - 15 с в пробирке типа "эппендорф" с 300 - 400 мкл ТЕ-буфера, избегая разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют.

13. В случае получения в образцах смывов положительных результатов ПЦР-анализа обработку повторяют.

14. Загрязненный расходный материал (пробирки, наконечники и т.п.) утилизируют.

Приложение 7

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА НА ИССЛЕДОВАНИЕ

1. Взятие материала производят согласно инструктивно-методическим документам, регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций, и в соответствии с СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)".

2. С целью предотвращения повреждения ДНК-мишеней возможно использование транспортных сред различного состава в зависимости от вида исследуемого материала. При необходимости длительного хранения и транспортирования при отсутствии низкотемпературных холодильников используют специальную транспортную среду ESP. Исследуемый материал может храниться в среде ESP при комнатной температуре (20 - 30 °С) в темном месте в течение 10 дней.

Транспортная среда N 1: NaCl 137 мМ, КСl 2,7 мМ, NaH2PO4 10 мМ, К2НРO4 2 мМ, сыворотка крупного рогатого скота 20%.

Транспортная среда N 2: сахароза 0,218 М, КН2РО4 0,0038 М, К2НРО4 0,0072 М, БСА 1%.

Транспортная среда ESP: саркозил 1%; ЭДТА 0,05 М; свободная от нуклеаз проназа Е 1 мг/мл.

3. Взятие биотического материала.

3.1. Кровь. Использование плазмы крови допустимо для проведения качественных и количественных исследований, использование сыворотки крови - только для проведения качественных исследований методом ПЦР.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Для получения плазмы забор крови производят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа "Venoject" (с ЭДТА), "Vacuett" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА). При взятии в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом (6%-ный раствор ЭДТА в соотношении 1:20 или 3,8%-ный раствор цитрата Na в соотношении 1:9). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом).

Для получения сыворотки забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или в стеклянную пробирку типа Vacuette без антикоагулянта. При взятии в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Плазму крови получают центрифугированием пробирок с цельной кровью при 800 - 1600 g (3000 об./мин.) в течение 20 мин. при комнатной температуре. Затем отбирают плазму в количестве не менее 1 мл отдельными наконечниками с аэрозольным барьером (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин. до полного образования сгустка. После чего сгусток обводят пастеровской пипеткой и оставляют при комнатной температуре до образования сыворотки. По другому варианту кровь со сгустком центрифугируют при 800 - 1600 g (3000 об./мин.) в течение 10 мин. при комнатной температуре. Затем сыворотку в количестве 1 мл переносят отдельными наконечниками с аэрозольным барьером (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ. Образцы цельной крови:

- при температуре 2 - 25 °С - в течение 6 ч с момента взятия материала для количественного определения нуклеиновых кислот; в течение 12 ч - для качественного определения нуклеиновых кислот;

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток для качественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов.

Недопустимо замораживание образцов цельной крови!

Образцы плазмы и сыворотки:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 5 суток;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала, поэтому образцы плазмы или сыворотки для длительного хранения желательно разлить небольшими (0,1 - 0,2 мл) порциями в отдельные стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ. Транспортирование клинического материала и предварительно обработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом.

Образцы крови:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч с момента взятия материала для количественного определения нуклеиновых кислот; в течение 12 ч - для качественного определения нуклеиновых кислот.

Образцы плазмы и сыворотки:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 3 суток;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.2. Моча.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не меньше 20 - 40 мл в специальный сухой стерильный флакон или сухую стерильную пробирку.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Взбалтывают флакон с мочой. Переносят 10 - 20 мл мочи в центрифужные пробирки объемом 20 - 40 мл с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 10 мин. при 10000 g (12000 об./мин.). Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют супернатант, не захватывая осадок. К осадку добавляют транспортную среду N 2 (см. п. 2) до конечного объема 0,2 мл, тщательно перемешивают содержимое на вортексе.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ.

Нативные и предварительно обработанные образцы мочи:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 20 °С - в течение 2 месяцев;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ. Транспортирование клинического материала и предварительно обработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.3. Фекалии.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Используют пробы фекалий массой (объемом) примерно 1 - 3 г (1 - 3 мл). Исследование мазков неинформативно из-за низкого содержания в них возбудителей. Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 г (примерно) отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. При исследовании нативных фекалий без предшествующего замораживания готовят фекальную суспензию (при водянистой консистенции фекалий в виде прозрачной жидкости фекальную суспензию не готовят).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФЕКАЛЬНОЙ СУСПЕНЗИИ. В соответствующее пробам количество микроцентрифужных пробирок (объемом 1,5 мл) вносят 0,9 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Состав фосфатного буфера: NaCl 137 мМ, КСl 2,7 мМ, NaH2PO4 10 мМ, К2НРО4 2 мМ; рН 7,5 + 0,2. В каждую пробирку отдельным наконечником с аэрозольным барьером (или одноразовыми лопатками) вносят 0,1 г (0,1 мл) фекалий и тщательно ресуспендируют на вортексе до образования гомогенной суспензии.

При невозможности исследования материала в течение суток и/или необходимости длительного хранения к 10 - 20%-ной суспензии фекалий в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида) добавляют глицерин в конечной концентрации 10 - 15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30 - 40 мин.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ ФЕКАЛИЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АГЕНТОВ. Для приготовления бактериальной фракции фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином. Пробирки с суспензией (водянистыми фекалиями) центрифугируют при 3000 g (5000 об./мин.) в течение 5 мин. Отдельным наконечником с аэрозольным барьером из каждой пробирки отбирают надосадочную жидкость и переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем центрифугируют при 10000 g (12000 об./мин.) в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 0,2 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОСВЕТЛЕННОГО ЭКСТРАКТА ФЕКАЛИЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ АГЕНТОВ (ТОРС). Для приготовления осветленного экстракта фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином. Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе. Осветляют полученную суспензию путем центрифугирования при 10000 g (12000 об./мин.) в течение 5 мин. Супернатант (0,1 мл) смешивают с отрицательным контрольным образцом (50%-ная сыворотка крови крупного рогатого скота, разведенная фосфатно-солевым буфером, состав которого указан выше) (0,1 мл) в соотношении 1:1 и используют непосредственно для выделения РНК. При необходимости хранения супернатант отбирают в отдельную одноразовую пробирку.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ.

Образцы нативных фекалий:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток.

Фекальная суспензия с глицерином, бактериальная фракция и осветленный фекальный экстракт:

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ. Транспортирование клинического материала и предобработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом.

Образцы нативных фекалий:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток.

Предварительно обработанные пробы:

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.4. Спинномозговая жидкость (ликвор).

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Спинномозговую жидкость получают путем прокола поясничной, субокципитальной области или мозговых желудочков одноразовыми пункционными иглами. Взятие ликвора в количестве не менее 0,5 - 1 мл проводят в одноразовые пластиковые пробирки объемом 1,5 мл.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Не требуется.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.5. Биопсийный и аутопсийный материал.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Микробиоптат (пунктат)/микроаутоптат помещают в микропробирки с закручивающимися крышками или пробирки объемом 1,5 мл с защелкой, содержащие 0,1 мл физиологического раствора или транспортной среды. Макробиоптат/макроаутоптат помещают в контейнер с физиологическим раствором или транспортной средой N 2 (см. п. 2).

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Микробиоптаты (пунктаты)/микроаутоптаты печени, селезенки и т.д., помещенные в микропробирки с закручивающимися крышками или пробирки объемом 1,5 мл с защелкой, содержащие 0,1 мл транспортной среды N 2 (см. п. 2), предварительной обработки не требуют. Далее выделение нуклеиновых кислот проводят согласно инструкции комплекта для выделения.

МАКРОБИОПТАТЫ/МАКРОАУТОПТАТЫ. При выявлении вирусных агентов кусочки ткани массой 0,1 - 1 г помещают в охлажденную фарфоровую ступку и добавляют охлажденный изотонической раствор объемом 0,5 - 1 мл. Измельчают стерильными ножницами с последующим растиранием пестиком. Через ватный тампон отбирают надосадочную жидкость (0,1 - 0,2 мл) стерильным наконечником с аэрозольным барьером в стерильные микропробирки.

При выявлении бактериальных агентов процесс подготовки макробиоптатов/макроаутоптатов аналогичен, только ступку и изотонический раствор не охлаждают.

По другому способу биоптат непосредственно перед выделением нуклеиновых кислот помещают в жидкий азот, затем аккуратно измельчают его пестиком в предварительно охлажденной жидким азотом фарфоровой ступке. Взвешивают 100 мг кусочков ткани и растирают их в ступке в жидком азоте до порошка. Затем для выделения РНК порошок переносят в гомогенизатор и следуют инструкции по выделению РНК. Для выделения ДНК к полученному порошку добавляют равный объем стерильного физиологического раствора (0,1 мл), тщательно перемешивают и отбирают необходимый объем материала согласно инструкции для выделения ДНК.

Фарфоровая посуда, а также гомогенизаторы должны быть предварительно обработаны хромпиком и простерилизованы. При гомогенизации нескольких образцов необходимо после каждой пробы протирать поверхность стола 0,2%-ным раствором ДП-2Т, затем водой и 70%-ным этиловым спиртом и менять перед обработкой следующей пробы перчатки.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА.

Образцы биопсийного и аутопсийного материала, предназначенного для выделения РНК:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Образцы биопсийного и аутопсийного материала, предназначенного для выделения ДНК:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч;

- в замороженном виде - в течение 1 суток (только для материала, предназначенного для выделения ДНК).

3.6. Мокрота.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Взятие материала осуществляют в количестве не менее 0,5 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы (пробирки) с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50 мл.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Перед выделением нуклеиновых кислот необходимо провести разжижение мокроты, используя раствор "Муколизин" (Na2HPO4 77,4 мМ, NaH2PO4 22,6 мМ, бета-МЭ 99,4 мМ, 5%-ный азид натрия в конечной концентрации 0,05%). В емкость с мокротой добавляют "Муколизин" в соотношении 5:1 (5 частей "Муколизина" к 1 части мокроты), ориентируясь по градуировке емкости. В процессе разжижения мокроты (20 - 30 мин.) емкость периодически встряхивают. Затем автоматической пипеткой, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой или в микроцентрифужную пробирку с защелкой на 1,5 мл и центрифугируют при 8000 g (10000 об./мин.) в течение 10 мин. В случае исследования на бактериальные агенты полностью удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой, осадок ресуспендируют в фосфатном буфере, доводя общий объем пробы до 0,1 мл. При исследовании на наличие вирусных агентов после центрифугирования отдельным наконечником с аэрозольным барьером отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.7. Бронхо-альвеолярный лаваж или промывные воды бронхов.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Взятие материала осуществляют в одноразовые, плотно завинчивающиеся пробирки объемом 50 мл.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Промывные воды бронхов или бронхо-альвеолярный лаваж перемешивают встряхиванием (вращением) пробирки. Автоматической пипеткой, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл клинического материала, помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой или пробирку с защелкой на 1,5 мл и центрифугируют при 7000 g (10000 об./мин.) в течение 10 мин. Затем в случае исследования на бактериальные агенты аккуратно с помощью вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой отбирают супернатант, оставив 0,1 мл надосадочной жидкости. При исследовании на наличие вирусных агентов после центрифугирования отдельным наконечником с аэрозольным барьером отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.8. Мазки из полости носа.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Мазки (слизь) берут сухими стерильными ватными тампонами. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2 - 3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой N 2 (см. п. 2). Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10 - 15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Не требуется.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА:

- при комнатной температуре - в течение 6 ч;

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.9. Мазки из ротоглотки.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой N 2 (см. п. 2). Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10 - 15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Не требуется.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА:

- при комнатной температуре - в течение 6 ч;

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.10. Смывы из полости носа.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Взятие материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью зонда или одноразового шприца вводят по 3 - 5 мл теплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания паром под давлением.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Не требуется.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.11. Смывы из ротоглотки.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Перед взятием смывов из ротоглотки проводят предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10 - 15 с) 8 - 10 мл изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания паром под давлением.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Не требуется.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 6 ч;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.12. Пунктат бубона.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Взятие материала производят стерильным шприцем. Если бубон имеет сохранившуюся кожу (невскрывшийся бубон), то ее протирают предварительно спиртом. Пункцию бубона производят как в его центре, так и на периферии. Из вскрывшегося бубона материал забирают в местах с сохраненной тканью, а также берут отделяемое бубона. Исследуемый материал в количестве 0,1 - 0,3 мл помещают в пробирку с транспортной средой N 2 или ESP (см. п. 2).

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Не требуется.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С или в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.13. Везикулы, пустулы.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Перед взятием материала кожные элементы очищают ватным тампоном, смоченным эфиром или спиртом, затем прокалывают их у основания стерильной иглой или тонким капилляром пастеровской пипетки. Для ускорения поступления материала элемент сверху надавливают пинцетом. Корку или верхнюю часть везикул отделяют от кожи иглой, скальпелем. Исследуемый материал помещают в пробирку с транспортной средой N 2 или ESP (см. п. 2).

Предварительная обработка материала, условия хранения и транспортирования - как в п. 3.12.

4. Пробы из объектов окружающей среды.

Пробы окружающей среды транспортируют в лабораторию в течение не более 2 - 3 ч при температуре не выше 20 °С; если нет возможности транспортирования образцов, их хранят при температуре минус 20 °С (в течение 6 мес.).

4.1. Пищевые продукты.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Пробы отбирают с соблюдением правил асептики в стерильные широкогорлые банки с помощью стерильной ложки, пинцета или ножа. Края банок обжигают над пламенем спиртовки. После закладки проб банки закрывают стерильной бумагой и перевязывают.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Твердые пищевые продукты в количестве 1 - 10 г помещают в стерильную ступку, добавляют 0,9%-ный раствор натрия хлорида в соотношении 1:10 и растирают до гомогенного состояния. Отстаивают и через ватный тампон отбирают надосадочную жидкость, из которой проводят выделение ДНК. Жидкие пищевые продукты в объеме 0,2 мл переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для выделения ДНК.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА:

- при температуре 2 - 8 °С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 °С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛА. Транспортирование материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8 °С или в замороженном виде - в течение 1 суток.

4.2. Клещи, комары и эктопаразиты (вши и блохи).

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. После взятия и доставки материала в лабораторию комаров, клещей, блох и вшей усыпляют эфиром до обездвижения, нанося каплю эфира на ватно-марлевую пробку. После определения вида и пола материал может быть объединен в пулы в зависимости от вида, пола, места и даты сбора и помещен в сухие чистые пробирки объемом 1,5 мл.

Группировку проб осуществляют в соответствии с МУ 3.1.1027-01 "Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций". При исследовании на чуму в одну пробу включают по 20 - 30 (не более 50) блох или мелких клещей, вшей. Иксодовых клещей при исследовании на чуму и другие природно-очаговые инфекции исследуют отдельно по фазам развития и в одну пробу берут пивших самок не более трех, голодных - до 30; нифм пивших - до 15, голодных - до 50; личинок пивших - до 30. При исследовании на туляремию в одну пробу объединяют до 50 имаго иксодовых клещей, 50 - 100 нифм и 100 - 200 личинок. Блох, гамазовых клещей, вшей исследуют до 100 особей в пробе. Из кровососущих двукрылых группируют пробы, включая в одну до 100 комаров, до 250 мошек и 20 - 25 слепней. При исследовании на арбовирусные инфекции комаров объединяют в пулы по 50 - 100 экземпляров. При необходимости проводят исследования отдельных особей.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ:

- клещей помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, куда вносят 1 мл 96%-ного этанола, встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 3 - 5 с при 2000 g (5000 об./мин.) для удаления капель с крышки пробирки;

- с помощью вакуумного отсасывателя отдельными наконечниками для каждой пробы удаляют спирт из пробирки;

- вносят в пробирку 1 мл 0,15 М раствора хлорида натрия, встряхивают пробирку и осаждают капли с крышки пробирки на микроцентрифуге в течение 3 - 5 с при 2000 g (5000 об./мин.);

- с помощью вакуумного отсасывателя отдельными наконечниками для каждой пробы удаляют раствор хлорида натрия из пробирки;

- переносят клещей в стерильную фарфоровую чашку, добавляют 0,7 мл 0,15 М раствора хлорида натрия и гомогенизируют пробу;

- наконечником с аэрозольным барьером переносят пробу в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 1 мин. для осветления пробы.

РНК и ДНК выделяют из 0,1 мл надосадочной жидкости.

При выделении РНК и ДНК из комаров, блох и вшей используют данную методику обработки проб, за исключением этапов отмывки в 96%-ном этаноле и 0,15 М растворе хлорида натрия. Насекомых и комаров сразу гомогенизируют в стерильной ступке в 0,15 М растворе хлорида натрия.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ. Материал после разбора и формирования проб:

- при температуре минус 20 °С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 °С или в сосуде Дьюара с жидким азотом - длительно.

Обработанный материал (после гомогенизации и осветления) хранится длительно при температуре минус 70 °С или в сосуде Дьюара с жидким азотом.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

4.3. Почва, трава, фураж, подстилка.

ВЗЯТИЕ ПРОБ. Пробы почвы с мест вероятного обсеменения патогенными микроорганизмами (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут в количестве 20 - 30 г на глубине до 15 см, на территории скотомогильников - на глубине до 2 м с помощью почвенных буров. При этом верхний слой почвы (2 - 3 см) снимают.

Пробы фуража берут из поверхностного слоя - не менее 400 г на 4 кв. м поверхности при незатаренном типе хранения. Из брикетированного корма срезают верхний слой брикета. Отбор проб проводят сухим стерильным пробным щупом. Пробы грубых кормов (сено, солома) берут из разных мест скирды при помощи ножниц и пинцета из расчета одна проба (40 г) на 4 кв. м площади скирды. Отобранные навески сена и соломы измельчают при помощи ножниц и пинцета на листе бумаги, затем помещают в банки. Зеленую массу, срезанную ножницами, помещают пинцетом в пробирку или в банку.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. К исследуемому материалу добавляют 0,9%-ный раствор натрия хлорида 1:10, тщательно перемешивают в течение 15 мин., отстаивают в течение 10 мин. для оседания крупных частиц. Надосадочную жидкость дробно центрифугируют: первоначально в течение 2 - 3 мин. при 5000 об./мин., затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин. при 12000 об./мин. Осадок ресуспендируют в 0,2 - 0,5 мл дистиллированной воды.

Условия хранения и транспортирования - как в п. 4.1.

4.4. Вода, стоки, смывы.

ВЗЯТИЕ ПРОБ. Водопроводную воду и воду из поверхностных водоемов для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой. Из водопроводных кранов отбор проб воды производят после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин. при полном открытии крана.

Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя способами: в объеме 1 л в двух емкостях по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10 х 15 см в 10 - 15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через 1 сутки помещают в стерильную банку, содержащую физиологический раствор.

Смывы с поверхностей берут стерильными ватными тампонами или марлевыми салфетками. Перед взятием смывов тампоны или салфетки смачивают стерильным физиологическим раствором. После взятия смыва тампон (салфетку) погружают в емкость с физиологическим раствором.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ. Из отобранных образцов переносят по 125 мл в 4 центрифужных стакана объемом 250 мл с завинчивающимися крышками и центрифугируют в течение 15 мин. при 12000 об./мин. После чего осадок в каждом стакане ресуспендируют в 0,2 мл физиологического раствора. Полученные суспензии переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 8000 g (12000 об./мин.) в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с аэрозольным барьером в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения ДНК используют 0,1 - 0,2 мл надосадочной фракции.

Условия хранения и транспортирования - как в п. 4.1.