Использование прибора EASYMAG как универсального экстрактора нуклеиновых кислот из клинического материала для последующего ПЦР-анализа с помощью коммерческих тест-систем разных производителей

Использование прибора EASYMAG как универсального экстрактора нуклеиновых кислот из клинического материала для последующего ПЦР-анализа с помощью коммерческих тест-систем разных производителей

Огромное количество тестов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, разработано и широко используется в мире. Дальнейшие разработки в этой области направлены на сокращение времени и упрощение процедуры анализа, а также уменьшение ручного труда. Выделение нуклеиновых кислот микроорганизмов из клинического материала является наиболее трудоемким этапом ПЦР-анализа. Особенно сложной и длительной является методика выделения РНК.

В настоящее время разработано большое количество автоматических систем, осуществляющих экстракцию нуклеиновых кислот. Но часть из них является «закрытыми» системами, которые разработаны только для работы с определенными тест-системами. Например, прибор AmpliPrep предназначен для работы с тест-системами «Cobas Amplicor» («Hoffmann-La Roche», Швейцария) или прибор «m2000rt» для тест-систем «Abbott Real-time». Другие приборы не валидированы для работы с разным клиническим материалом и с разными коммерческими тест-системами.

Прибор easyMAG (BioMerieux, Франция) является относительно новым прибором для автоматической экстракции нуклеиновых кислот. Принцип экстракции, используемый в приборе, основан на сорбции нуклеиновых кислот сорбентом. Эта методика ранее была описана Boom и соавт. и широко использовалась в «ручном» варианте, зарекомендовав себя как золотой стандарт среди методов экстракции нуклеиновых кислот.

Особый интерес к данному прибору связан с такими особенностями как «открытость», позволяющая осуществлять экстракцию по собственному протоколу, работать с любым клиническим материалом и использовать выделенные нуклеиновые кислоты в любых тестах. Однако, работ по использованию экстрактора в клинической практике опубликовано достаточно мало. Тем более, нет работ по адаптации прибора к коммерческим тестам.

Цель работы

Целью настоящей работы было оценить возможность использования прибора easyMAG для выделения РНК из плазмы крови для последующего ПЦР-анализа в коммерческих тестах разных производителей, которые широко используются на Российском рынке.

Материалы и методы

В настоящем исследовании были использованы 3 тест-системы, предназначенные для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови: Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v.1.5 (Hoffmann-La Roche), Abbott Real-Time HIV-1 и АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT (ФГУН ЦНИИЭ).

Образцы крови были получены от ВИЧ-инфицированных пациентов г. Москвы и Московской области в период 2006-2007 гг. Кровь забирали у пациентов утром натощак в пробирку с 3%-ным ЭДТА из расчета 1:20. Для получения плазмы цельную кровь центрифугировали при 800-1600 g в течение 20 минут. Плазму хранили при температуре минус 700С. Количество протестированных образцов представлено в таблице 1.

Все образцы тестировали, используя одновременно два варианта экстракции РНК: «ручной» (согласно инструкции к тест-системе) и автоматический (с использованием прибора easyMAG).

Автоматическую экстракцию РНК из плазмы крови осуществляли с помощью реактивов производства BioMerieux, прилагаемых к прибору, по следующему протоколу: лизис клинического материала проводили вне прибора с добавлением внутреннего контроля (по протоколу соответствующей тест-системы), остальные этапы экстракции выполнялись в приборе в автоматическом режиме.

Анализ результатов

Полученные результаты концентрации РНК перед анализом логарифмировали. Рассчитывали коэффициенты корреляции (по Спирмену) и разницу между результатами, полученными с помощью автоматического и «ручного» вариантов экстракции РНК.

Результаты и обсуждение

При сравнении автоматического и ручного методов выделения РНК из плазмы крови была выявлена идентичная эффективность выявления РНК ВИЧ. Однако, отношение эффективностей экстракции РНК ВИЧ и ВКО часто была не одинаковой для «ручного» и автоматического методов. Поэтому для каждой исследуемой тест-системы нами был рассчитан коэффициент регрессии и введен корректирующий коэффициент в количественные результаты. При сравнении количественных результатов, полученных с использованием разных способов экстракции РНК, была показана хорошая корреляция для каждой анализируемой тест-системы (табл. 1). После введения корректирующих коэффициентов оказалось, что разница между результатами не превышает 0,5 lg, что свидетельствует о высокой сходимости результатов (табл. 1).

Таблица 1. Сравнение результатов вирусной нагрузки, полученных с помощью «ручной» и автоматической пробоподготовки.

Тест-система	Коэффициент корреляции	Максимальная разница (lg)	Количество протестированных образцов
Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v.1.5	0,99	0,34	30
Abbott Real-Time HIV-1	0,96	0,24	21
АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT	0,96	0,39	23

Заключение

Хорошая корреляция результатов вирусной нагрузки, полученных с использованием прибора easyMAG и стандартной методики пробоподготовки, а также небольшой разброс между количественными результатами указывают на возможность использования прибора easyMAG с любыми коммерческими тест-системами, даже «закрытыми».