Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

05.05.2010

Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» - ВАРИАНТ FRT

Состав

Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT включает:

Реагент	Описание	Объем, мл	Кол-во
ПЦР-смесь-1-FL	Раствор, содержащий праймеры, дНТФ и олигонуклеотидные зонды	0,01	110 пробирок объемом 0,2 мл
ПЦР-смесь-2-FL-red	Буферный раствор, содержащий Taq-полимеразу, Mg2+	1,1	1 пробирка
ПКО комплексный	Раствор, содержащий специфические фрагменты ДНК анализируемых микроорганизмов (в составе генно-инженерных конструкций)	0,2	1 пробирка
ДНК-буфер	Буферный раствор	0,5	1 пробирка

Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли.
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F включает:

Реагент	Описание	Объем, мл	Кол-во
ПЦР-смесь-1-FL	Раствор, содержащий праймеры, дНТФ и олигонуклеотидные зонды	1,2	1 пробирка
ПЦР-смесь-2-FRT	Буферный раствор, содержащий Mg2+	0,3	2 пробирки
Полимераза (TaqF)	Раствор, содержащий Taq-полимеразу модифицированную	0,03	2 пробирки
ПКО комплексный	Раствор, содержащий специфические фрагменты ДНК анализируемых микроорганизмов (в составе генно-инженерных конструкций)	0,2	1 пробирка
ДНК-буфер	Буферный раствор	0,5	1 пробирка

Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли.

Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-1000 F включает:

Реагент	Описание	Объем, мл (мл)	Кол-во
ПЦР-смесь-1-FL	Раствор, содержащий праймеры, дНТФ и олигонуклеотидные зонды	1,2	10 пробирок
ПЦР-смесь-2-FRT	Буферный раствор, содержащий Mg2+	1,2	5 пробирок
Полимераза (TaqF)	Раствор, содержащий Taq-полимеразу модифицированную	0,12	5 пробирок
ПКО комплексный	Раствор, содержащий специфические фрагменты ДНК анализируемых микроорганизмов (в составе генно-инженерных конструкций)	1,0	1 пробирка
ДНК-буфер	Буферный раствор	0,5	2 пробирки

Комплект реагентов рассчитан на проведение 1100 реакций амплификации, включая контроли.

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ C ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»

А. Подготовка пробирок для проведения амплификации
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени».
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.
А1. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT
Общий объем реакционной смеси – 30 мкл, включая объем пробы ДНК – 10 мкл.

1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FL для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.
2. На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2-FL-red, при этом она
   не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FL.
3. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых или контрольных образцов.
4. Поставить контрольные реакции:

а) отрицательный контроль ПЦР (К-) – внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.
б) положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО комплексного.
в) отрицательный контроль экстракции ДНК (B-) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ОКО.
А2. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F и FRT-1000 F
Общий объем реакционной смеси – 25 мкл, включая объем пробы ДНК – 10 мкл.

1. Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-2-FRT. Перемешать содержимое пробирок, содержащих ПЦР-смесь-1-FL, ПЦР-смесь-2-FRT и полимеразой (TaqF), и осадить капли кратковременным центрифугированием (1-2 с) с помощью центрифуги/вортекса.
2. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.
3. Для проведения N реакций (включая 2 контроля ПЦР) смешать в отдельной пробирке 10*(N+1) мкл ПЦР-смеси-1-FL, 5,0*(N+1) мкл ПЦР-смеси-2-FRT и 0,5*(N+1) мкл полимеразы (TaqF).
4. Перемешать подготовленную смесь и осадить капли кратковременным центрифугированием с помощью центрифуги/вортекса.
5. Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной смеси.
6. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых или контрольных образцов.
7. Поставить контрольные реакции:

а) отрицательный контроль ПЦР (К-) – внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.
б) положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО комплексного.
в) отрицательный контроль экстракции ДНК (B-) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ОКО.

Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»

1. Запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени») для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала «АмплиСенс-1» (см. табл. 18).

Таблица 18

Программа «АмплиСенс-1»

	Приборы роторного типа1			Приборы планшетного типа2
Цикл	Температура, °С	Время	Кол-во циклов	Температура, °С	Время	Кол-во циклов
1	95	15 мин	1	95	15 мин	1
2	95	5 с	5	95	5 с	5
	60	20 с		60	20 с
	72	15 с		72	15 с
3	95	5 с	40	95	5 с	40
	60	20 с детекция флуоресц. сигнала		60	30 с детекция флуоресц. сигнала
	72	15 с		72	15 с

Детальная информация о программировании различных приборов для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» представлена в разделе «Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов».

2. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора.
3. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала.
4. По окончании выполнения программы приступить к анализу результатов.

¹ например, «Rotor-Gene» 3000, «Rotor-Gene» 6000, «Rotor-Gene Q» или аналогичные.
² например, «iCycler», «iQ5», «Mx3000P», «Mx3000», «ДТ-96» или аналогичные.

АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР c детекцией в режиме «реального времени». Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по каналам для регистрации накопления продуктов амплификации фрагментов ДНК каждого из выявляемых микроорганизмов и по каналу для регистрации продукта амплификации ДНК ВКО.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или, соответственно, отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.
Для анализа результатов по каждому каналу необходимо установить на соответствующем уровне пороговую линию и включить необходимые опции обработки данных в соответствии с описанием для используемого прибора и набора реагентов в разделе «Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов».

При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
- по каналу для флуорофора JOE регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

Принцип интерпретации результатов следующий:

• ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM определено значение порогового циклаCt. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
• ДНК микроорганизма необнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для флуорофора JOE определено значение порогового цикла Ct, не превышающее указанное (граничное) значение.
• Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу для флуорофора FAM, и по каналу для флуорофора JOE значение Ctтакже не определено (отсутствует) илипревышает указанное граничное значение. В этом случае требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего клинического образца.

ВНИМАНИЕ! Граничные значения Ct указаны во вкладыше к ПЦР-комплекту и в разделе «Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов» данных методических рекомендаций.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (табл. 19).
Таблица 19
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Ct
		по каналу для флуорофора FAM	по каналу для флуорофора JOE
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение меньше граничного
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение меньше граничного

Возможные ошибки и их устранение
1. Если для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла по каналу для флуорофора FAM отсутствует или превышает граничное значение, необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК микроорганизма.
2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) зафиксировано значение порогового цикла по каналу для флуорофора FAM, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена ДНК микроорганизма, начиная с этапа экстракции ДНК.
ВНИМАНИЕ! Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) повторно зафиксировано значение порогового цикла по каналу для флуорофора FAM, причиной этого может являться контаминация рабочих зон лаборатории и (или) реагентов продуктами амплификации или ДНК микроорганизмов. В таком случае необходимо провести мероприятия, направленные на выявление и устранение возможной контаминации рабочих зон лаборатории и реагентов.
3. Если для пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM зафиксировано значение порогового цикла, но график флуоресценции по этому каналу не имеет правильной формы с участком характерного экспоненциального подъема флуоресценции (в частности, если график представляет собой прямую линию), этот результат является ошибочным, его нельзя интерпретировать как положительный результат. Такой результат может свидетельствовать о неправильно установленном уровне пороговой линии (или других параметров анализа). Если же он получен при правильном уровне порога (и других параметрах), то необходимо повторить для данной пробы (проб) амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» для получения правильного результата.
При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК ВКО. Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО указано в табл. 20 и в инструкции к используемому набору реагентов.
Наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» можно разделить на две группы: наборы для одновременного выявления трех или четырех различных микроорганизмов – группа 1, и наборы для одновременного выявления двух микроорганизмов («дуплексы») – группа 2.
Сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО, при работе с наборами первой группы регистрируется по каналу для флуорофора Cy5, а при работе с наборами второй группы («дуплексами») – по каналу для флуорофора ROX.

Таблица 20

Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО

Набор (тест), группа 1	Канал для флуорофора
	FAM	JOE	ROX	Cy5	Cy5.5 (Crimson) *
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium/ T.vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО	Trichomonas vaginalis
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium/ M.hominis	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО	Mycoplasma hominis
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО	-
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma hominis	ВКО	-
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ T. vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Trichomonas vaginalis	ВКО	-
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО	-
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	Candida albicans	Candida glabrata	Candida krusei	ВКО	-
Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»
U. parvum / U. Urealyticum	Ureaplasma parvum	Ureaplasma urealyticum	ВКО	-	-
HSV-typing	HSV II	HSV I	ВКО	-	-
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	Trichomonas vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	ВКО	-	-
HSV / CMV	HSV	CMV	ВКО	-	-

*) Канал для флуорофора Сy5.5 (канал Crimson) имеется у приборов «Rotor-Gene 6000» и «Rotor-Gene Q».
Принцип интерпретации результатов следующий:

• ДНК микроорганизмаобнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК данного микроорганизма (в соответствии с инструкцией к используемому набору) определено значение порогового циклаCt. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
• ДНК микроорганизма необнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по соответствующему каналу не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию).
• ДНК ни одного из анализируемых микроорганизмов необнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каждому из каналов для регистрации сигнала об амплификации ДНК анализируемых микроорганизмов не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct(кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК ВКО определено значение порогового цикла Ct, не превышающее указанное (граничное) значение.
• Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК микроорганизмов и по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК ВКО значение Сtтакже не определено (отсутствует) илипревышает указанное граничное значение. В этом случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

Граничные значения Ct указаны во вкладыше к ПЦР-комплекту и в разделе «Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов» данных методических рекомендаций.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции (выделения) ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (табл. 21).

Таблица 21

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Ct
		по каналам для регистрации сигнала об амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК ВКО
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение меньше граничного
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение меньше граничного

Возможные ошибки и их устранение
1. Если для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла отсутствует или превышает граничное по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов, необходимо повторить амплификацию для всех проб, для которых отсутствует значение порогового цикла по этим каналам.
2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) зафиксировано значение порогового цикла по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, для которых зафиксировано значение порогового цикла по этому каналу (каналам), начиная с этапа экстракции ДНК.
ВНИМАНИЕ! Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) повторно зафиксировано значение порогового цикла по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов, причиной этого может являться контаминация рабочих зон лаборатории и (или) реагентов продуктами амплификации или ДНК микроорганизмов. В таком случае необходимо провести мероприятия, направленные на выявление и устранение возможной контаминации рабочих зон лаборатории и реагентов.

3. Если для пробы в таблице результатов по определенному каналу зафиксировано значение порогового цикла, но график флуоресценции по этому каналу не имеет правильной формы с участком характерного экспоненциального подъема флуоресценции (в частности, если график представляет прямую линию), этот результат является ошибочным, его нельзя интерпретировать как положительный результат. Такой результат может свидетельствовать о неправильно установленном уровне пороговой линии (или других параметров анализа). Если же такой результат получен при правильном уровне порога (и других параметрах), то необходимо повторить для данной пробы амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» для получения достоверного результата.

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ПРИБОРОВ

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «Rotor-Gene» 3000 или 6000 или «Rotor-Gene Q»

Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу «Rotor-Gene» 6 версии 6.1 или выше, с прибором «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» - русифицированную программу «Rotor-Gene» 6000 версии 1.8.17.5 (или выше) или программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build 67) или выше.

А1. Создание шаблона для программы с русскоязычным интерфейсом

• Для создания шаблона следует выбрать в окне Новый тест режим Детальный мастер. Выбрать любой шаблон (например, Двухшаговый цикл) для редактирования и нажать кнопку Новый.
• В следующем окне выбрать тип ротора: 36-луночный ротор. Установить галочку в строке Кольцо закреплено.
• В окне, следующем после окна выбора ротора, необходимо установить объем реакционной смеси равный 25 в строке Объем реакции. Установить галочку в боксе в строке 15 ?L с добав. воска, чтобы активировать эту опцию.
• В окне Редактор профиля следует задать программу «АмплиСенс-1»:

• Удерж. темп-ры 95 °С - 15 мин
• Циклирование
  95 °С - 5 с
  60 °С - 20 с
  72 °С - 15 с
  

Цикл повторить – 5 раз.

• Циклирование 2
  95 °С - 5 с
  60 °С - 20 с – Детекция *
  72 °С - 15 с

Цикл повторить – 40 раз.

* Детекция флуоресцентного сигнала назначается на втором шаге (60 °С) второго блока циклирования (Детек. на CyclingA / AcquiringtoCyclingA) по каналам Green, Yellow, Orange,Red, Crimson.
ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения тестов с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» для выявления ДНК возбудителей ИППП и др. инфекций органов репродукции. Поэтому можно одновременно в одном приборе проводить все эти тесты или любое их сочетание, включая все тесты для выявления и генотипирования вирусов папилломы человека (ВПЧ ВКР).
При работе только с «ПЦР-комплектами» вариант FRT, в которых используется прослойка воска, можно вместо программы «АмплиСенс-1» использовать альтернативную программу «60-45 RG» (что позволяет сократить на 10 мин время выполнения амплификации и детекции прибором). Для этого надо создать отдельный шаблон «60-45», в котором в окне Редактор профиля задать альтернативную программу «60-45 RG»:

• Удерж. темп-ры 95 °С - 5 мин
• Циклирование
  95 °С - 5 с
  60 °С - 20 с
  72 °С -15 с

Цикл повторить – 5 раз.

• Циклирование 2
  95 °С - 5 с
  60 °С - 20 с – Детекция *
  72 °С -15 с

Цикл повторить – 40 раз

Детекция флуоресцентного сигнала назначается также как для программы «АмплиСенс-1».
Задав программу амплификации и детекции, нажать кнопку OK.
5. Задать автоматическую калибровку для выбора параметра Уровень сигнала. Для этого в окне Установки каналов нажать кнопку Опт.уровня сигн. В открывшемся окне Авто-оптимизация уровня сигнала нажать кнопку Опт. Детек-мых. В строке Нужный диапазон стартового сигнала для канала Green нужно указать минимальный сигнал - 5, а максимальный сигнал - 10.
Для каналов Yellow, Orange, RedиCrimson нужно указать минимальный сигнал - 4, а максимальный сигнал - 8. В графе Позиция пробирки должен быть указан номер пробирки - 1, по сигналу которой будет автоматически выбран параметр Уровень сигнала. Пометить галочкой бокс в строке Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции. Закрыть окно Авто-оптимизация уровня сигнала.
6. Перейти в следующее окно. Сохранить запрограммированный шаблон выполнения теста. Для этого нажать кнопку Сохр.шаблон. Задать имя для файла шаблона, соответствующее заданной в нем программе амплификации - «АмплиСенс-1» или «60-45 RG». Сохранить файл в предлагаемую папку: Templates\QuickStartTemplates; закрыть окно Мастер Нового Теста. После этого запрограммированный шаблон теста появится в списке шаблонов в окне Новый тест.
Запрограммированный согласно данному описанию шаблон теста можно использовать для запуска любых тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП и др. инфекций органов репродукции с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT, FRT-100F и FRT-1000F (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).
Примечание. Чтобы редактировать таблицу образцов до старта выполнения программы теста, необходимо выбрать в меню Файл подменю Предпочтения и в открывшемся окне (вкладка Установки пользователя пункт Опции редактирования образцов) выбрать пункт Редактировать образцы перед стартом теста.

А2. Создание шаблона для программы с англоязычным интерфейсом.
Далее по тексту термины, соответствующие разным моделям приборов, указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для прибора «Rotor-Gene» 6000 (или «Rotor-Gene Q»). Если термины совпадают для разных моделей прибора, то указан один термин.

• Для программирования и создания шаблона следует выбрать в окне NewRunрежим программирования Advanced. Выбрать любой шаблон (например, Hydrolysisprobes / DualLabeledProbe) для редактирования и нажать кнопку New. В следующем окне выбрать тип ротора 36-WellRotor. Установить галочку в строке No Domed Tubes / Locking Ring Attached.
• В окне, следующем после окна выбора ротора, необходимо установить объем реакционной смеси ReactionVolume(?L).
• Для прибора «Rotor-Gene» 3000 вводится значение 30.
• Для прибора «Rotor-Gene» 6000 вводится значение 25, после чего необходимо установить галочку в боксе в строке 15 ?Loillayervolume, чтобы активировать эту опцию.

• В окне Edit Profile следует задать программу «АмплиСенс-1»:

• Hold 95 °С - 15 min
• Cycling
  95 °С - 5 sec
  60 °С - 20 sec
  72 °С -15 sec
  

Cycle repeats – 5 times

• Cycling 2
  95 °С - 5 sec
  60 °С - 20 sec – Acquiring *
  72 °С - 15 sec

Cycle repeats – 40 times

* Acquiring - детекция флуоресценции назначается на втором шаге (60 °С) второго блока циклирования (Acquiring to Cycling A) по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red, Crimson.
Задав программу амплификации и детекции, нажать кнопку OK.
ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения тестов с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» для выявления ДНК возбудителей ИППП. Поэтому можно одновременно в одном приборе проводить все тесты или любое их сочетание, включая тесты для выявления и генотипирования вирусов папилломы человека (ВПЧ ВКР).
При работе только с «ПЦР-комплектами» вариант FRT, в которых используется прослойка воска можно вместо программы «АмплиСенс-1» использовать альтернативную программу «60-45 RG» (что позволяет сократить на 10 мин время выполнения амплификации и детекции прибором). Для этого надо создать отдельный шаблон «60-45», в котором в окне Редактор профиля задать альтернативную программу «60-45 RG»:

• Hold 95 °С – 5 min
• Cycling
  95 °С - 5 sec
  60 °С - 20 sec
  72 °С -15 sec

Cycle repeats – 5 times

• Cycling 2
  95 °С - 5 sec
  60 °С - 20 sec – Acquiring *
  72 °С - 15 sec

Cycle repeats – 40 times

* Детекция флуоресцентного сигнала назначается так же, как для программы «АмплиСенс-1».
4. Задать автоматическую калибровку для выбора параметра «gain». Для этого в окне Channel Setup нажать кнопку Calibrate/Gain Optimisation. В открывшемся окне Auto Gain Calibration Setup нажать кнопку Calibrate Acquiring/Optimize Acquiring. Для канала FAM/Greenнужно указать в графе MinReadingзначение 5, а в графе MaxReadingзначение 10. Для каналов JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/RedиCrimsonнужно указать в графе MinReadingзначение 4, а в графе MaxReading–значение 8. В графе Tubeposition должен быть указан номер пробирки – 1, по сигналу которой будет автоматически выбран параметр «gain». Пометить галочкой бокс в строке Perform Calibration Before 1-st Acquisition/Perform Optimisation Before 1-st Acquisition. Закрыть окно AutoGainCalibrationSetup.
5. Перейти в следующее окно. Сохранить запрограммированный шаблон выполнения теста, нажав кнопку SaveTemplate. Задать имя для файла шаблона, соответствующее заданной в нем программе амплификации, – «АмплиСенс-1» или «60-45 RG». Сохранить файл в предлагаемую папку: Templates(и в ней в папку QuickStartTemplates) и закрыть окно NewRunWizard. После этого запрограммированный шаблон теста появится в списке шаблонов в окне NewRun.
Запрограммированный таким образом шаблон «АмплиСенс-1» можно использовать для проведения амплификации и детекции при проведении любых тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью комплектов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Б. Проведение амплификации и детекции с использованием готового шаблона

Б1. Для «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» с русскоязычным интерфейсом программы

• Установить пробирки в ротор. При этом в первой позиции должна быть установлена одна из подготовленных для анализа пробирок с реакционной смесью (см. Примечание 1 и 2). Установить фиксирующее кольцо, прикрепить ротор, совместив отверстие для фиксатора с фиксатором, закрыть крышку прибора.
• Для запуска с использованием готового шаблона выбрать в меню Новый, вверху окна Новый тест выбрать вкладку Детальный мастер, затем в списке шаблонов в этом окне выбрать нужный шаблон с программой амплификации и детекции «АмплиСенс-1» (запрограммированный согласно описанию в разделе «Создание шаблона»). При работе только с «ПЦР-комплектами» вариант FRT, в которых используется прослойка воска, можно использовать шаблон с другой программой амплификации и детекции - «60-45 RG».
• В окне выбора ротора выбрать тип ротора: 36-луночный ротор или 72-луночный ротор.Поставить галочку в боксе Кольцо закреплено. Перейти в следующее окно, нажав кнопку Далее.
• В следующем окне нужно проверить, что указан объем реакционной смеси Объем реакции равный 25 и в боксе 15 ?L с добав. воскаустановлена галочка, активирующая эту опцию.
• В окне таблицы образцов задать последовательность расположения образцов в роторе, указав для каждого образца его имя (идентификатор) и для всех образцов тип Образец.Нажать кнопку OK. Отредактировать таблицу образцов можно также после старта выполнения программы амплификации.

Примечание. Для редактирования таблицы образцов до старта нужно, чтобы предварительно в меню Файл подменю Предпочтения был выбран пункт Редактировать образцы перед стартом теста.
См. также Примечание 3.

• В следующем окне можно проверить правильность программ амплификации и детекции и условий авто-оптимизации уровня сигнала, заданных в шаблоне, в соответствии с пунктом 1. Перейти в следующее окно, нажав кнопку Далее. Примечание. Если не используются наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ», то в окне Редактор профиля каналы Orange, Red и Crimson можно выключить, оставив назначенной детекцию по каналам Green и Yellow.
• В последнемперед стартомокнезапустить выполнение программы прибором с помощью кнопки Стартв нижней части окна. При этом ротор должен быть уже прикреплен и крышка прибора закрыта. Задать имя файла, в котором будут сохранены результаты, и нажать кнопку Сохранить.
• После окончания выполнения программы амплификации приступить к учету результатов.

ВНИМАНИЕ! После окончания выполнения программы амплификации пробирки удаляют из ротора и утилизируют.
Примечание 1. Первая пробирка в роторе используется для автоматической оптимизации уровня сигнала, поэтому в 1-ой позиции в роторе должна находиться пробирка с реакционной смесью. При одновременном проведении различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью наборов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора в качестве 1-ой пробирки можно использовать пробирку с любой из подготовленных реакционных смесей. При одновременном проведении тестов с использованием наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» в 1-ую позицию в роторе необходимо помещать пробирку с реакционной смесью набора реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ», для которого используется максимальное число каналов.
Примечание 2. Нельзя использовать для заполнения ротора пробирки с ПЦР-смесью, ранее уже прошедшие амплификацию. Ячейки ротора допустимо оставлять незаполненными.
Примечание 3. При одновременном проведении тестов для выявления ДНК ВПЧ и различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью наборов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора следует в таблице образцов создать вторую страницу и в ней задать образцы, для которых проводится тест на наличие ДНК ВПЧ (тип «образец»), а для остальных образцов назначить тип «пустой». Это имеет значение для последующего анализа результатов.

Б2. Для «Rotor-Gene» 3000, «Rotor-Gene» 6000 и «Rotor-Gene Q» с англоязычным интерфейсом программы
Далее по тексту термины, соответствующие разным моделям приборов, указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для прибора «Rotor-Gene» 6000 (если термины совпадают для разных моделей прибора, то указан один термин).

• Установить пробирки в ротор. При этом в первой позиции должна быть установлена одна из подготовленных для анализа пробирок с реакционной смесью (см. Примечание 1 и 2). Установить фиксирующее кольцо, прикрепить ротор, совместив отверстие для фиксатора с фиксатором, закрыть крышку прибора.
• Для запуска с использованием готового шаблона выбрать в меню New Run, вверху окна New Run Wizardвыбрать вкладку Advanced. В списке шаблонов в этом окне выбрать нужный шаблон с программой амплификации и детекции «АмплиСенс-1» (запрограммированный согласно описанию в разделе «Создание шаблона»).

При работе только с «ПЦР-комплектами» вариант FRT, в которых используется прослойка воска, можно использовать шаблон с другой программой амплификации и детекции - «60-45 RG».

• В окне выбора ротора выбрать тип используемого ротора: 36-WellRotorили 72-WellRotor(соответственно, 36-луночный или 72-луночный).Установить галочку в строке No Domed Tubes / Locking Ring Attached. Перейти в следующее окно.
• В следующем окне можно проверить правильность указания объема реакционной смеси, а при работе с «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» проверить, что в боксе 15 ?Loillayervolumeустановлена галочка, активирующая эту опцию. Перейти в следующее окно.
• В следующем окне можно проверить правильность программы амплификации и детекции и условий авто-оптимизации уровня сигнала, заданных в шаблоне (в соответствии с описанием в разделе «Создание шаблона»).

Примечание. Если не используются наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ», то в окне EditProfileдетекцию поканалам ROX/Orange, Cy5/Red и Crimson можно выключить, оставив назначенной детекцию по каналам FAM/Green и JOE/Yellow.

• В последнемперед стартомокнезапустить программу с помощью кнопки Startв нижней части окна. При этом ротор должен быть уже прикреплен и крышка прибора закрыта. Задать имя файла, в котором будут сохранены результаты, и нажать кнопку Save.
• В окне таблицы образцов задать последовательность расположения образцов в роторе, указав для каждого образца его имя (идентификатор) и тип Unknown.Нажать кнопку Finish/OK.

Примечание. При работе с «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» можно редактировать таблицу образцов до старта. Для этого нужно предварительно в меню File, подменю Userpreferencesвыбрать пункт EditSamplesBeforeRunStarted.
См. также Примечание 3.

• После окончания выполнения программы амплификации приступить к учету результатов.

ВНИМАНИЕ! После окончания выполнения программы амплификации пробирки удаляют из ротора и утилизируют.
Примечание 1. Первая пробирка в роторе используется для автоматической оптимизации уровня сигнала, поэтому в 1-ой позиции в роторе должна быть помещена пробирка с реакционной смесью. При одновременном проведении в приборе нескольких различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в качестве 1-ой пробирки можно использовать пробирку с любой из подготовленных реакционных смесей, помещенную в 1-ю позицию в роторе. При одновременном проведении тестов с использованием наборов серии «МультиПрайм» в 1-ую позицию в роторе необходимо помещать пробирку с реакционной смесью реагентов набора серии «МультиПрайм», для которого используется максимальное число каналов.
Примечание 2. Нельзя использовать для заполнения ротора пробирки с ПЦР-смесью, ранее уже прошедшие амплификацию. Ячейки ротора допустимо оставлять незаполненными.
Примечание 3. При одновременном проведении тестов для выявления ДНК ВПЧ и различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью наборов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора следует в таблице образцов создать вторую страницу и в ней задать образцы, для которых проводится тест для выявления ДНК ВПЧ, а для остальных образцов назначить тип «none». Это имеет значение при последующем анализе результатов.

В. Анализ результатов, полученных при использовании приборов «Rotor-Gene» 3000 или 6000 и «Rotor-Gene Q»

В1. Анализ результатов при использовании программы с русскоязычным интерфейсом
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют графики накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам: по каналу Green регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма, по каналу Yellow регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

• Выбрать в главном меню значок меню Анализ, в ниспадающем меню выбрать вкладку Количественный. Выполнить операцию для данных канала Green, выбрав в поле «CyclingAGreen», затем для данных канала Yellow, выбрав в поле «CyclingAYellow».
• Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, регистрируемых по каналу Yellow.

Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Yellow. В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич.фон (включена по умолчанию). Включить кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии - в меню Вычисление Ct ввести в текстовом поле Порог значение 0,1. В таблице результатов по каналу Yellow будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Количественные результаты – CyclingA. Yellow» под окном графиков).

• Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК микроорганизма, регистрируемых по каналу Green.

Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Green. В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич. фон (включена по умолчанию). Кнопка Коррект. уклонадолжна быть выключена или включена в соответствии c указанным вариантом в табл. 22 для используемого набора реагентов. Нажать кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение, указанное в табл. 22 для используемого набора. Задать уровень пороговой линии: в меню Вычисление Ct ввести в текстовом поле Порог значение 0,1.В таблице результатов по каналу Green будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Количественные результаты – Cycling A. Green» под окном графиков).

Таблица 22

Параметры анализа результатов по каналу Green

Наименование набора	Порог	Устранение выбросов	Коррект. уклона
Chlamydia trachomatis	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae-скрин	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae-тест	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)	0,1	0	выключена
Mycoplasma genitalium	0,1	0	выключена
Ureaplasma species	0,1	0	выключена
Mycoplasma hominis	0,1	0	выключена
HSVI, II	0,1	0	выключена
CMV	0,1	0	выключена
Gardnerella vaginalis	0,1	0	выключена
Treponema pallidum	0,1	5	включена
Trichomonas vaginalis	0,1	5	включена
Candida albicans	0,1	0	выключена

• Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green определено значение порогового цикла Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green не определено (отсутствует) значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу Yellow определено значение Ct, не превышающее граничного значения 30.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green не определено значение порогового цикла Ct и в таблице результатов по каналу Yellow значение Ctтакже отсутствует или превышает 30. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 23 и 24).
Таблица 23
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа
при использовании наборов для выявления одного микроорганизма

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Ct
		по каналу Green	по каналу Yellow
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение <30
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение <30

Таблица 24

Граничные значения порогового цикла по каналу Green для положительного контроля

Наименование ПЦР-комплекта-FRT	Граничное значение Сt по каналу Green для «К+»
Chlamydia trachomatis	30
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	33
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

Пример полученных результатов:

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу Yellow (канал для ВКО) менее 30. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по обоим каналам не превышают граничных значений. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 2, 5 и 6 обнаружена ДНК выявляемого микроорганизма (определены значения Ct по каналу Green).
- В образцах 1, 3 и 4 не обнаружена ДНК микроорганизма. По каналу для ВКО - каналу Yellow - определены значения Ct менее 30.
При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагмента ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в табл. 25 и 26 и в инструкции (каналы Green, Yellow, Orange, Crimson). Результаты амплификации ДНК ВКО регистрируются при использовании наборов первой группы (для одновременного выявления трех или четырех различных микроорганизмов) – по каналу Red, а при использовании наборов второй группы (для одновременного выявления двух микроорганизмов) – по каналу Orange.
Результаты интерпретируются на основании данных, полученных по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО, согласно табл. 25 и 26.
Таблица 25
Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации
фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО
(для наборов группы 1)

Набор (тест), группа 1	Канал
	Green	Yellow	Orange	Red	Crimson
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium/ T.vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО	Trichomonas vaginalis
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium/ M.hominis	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО	Mycoplasma hominis
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО	-
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma hominis	ВКО	-
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО	-
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	Candida albicans	Candida glabrata	Candida krusei	ВКО	-

Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО
(для наборов группы 2)

Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»	Канал
	Green	Yellow	Orange
U. parvum / U. urealyticum	Ureaplasma parvum	Ureaplasma urealyticum	ВКО
HSV-typing	HSV II	HSV I	ВКО
T. vaginalis /N.gonorrhoeae	Trichomonas vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	ВКО
HSV / CMV	HSV	CMV	ВКО

• Чтобы проанализировать данные по определенному каналу, нужно выбрать в главном меню значок Анализ, в ниспадающем меню выбрать вкладку Количественный и нужный канал (например, канал Green - «CyclingAGreen», канал Yellow - «CyclingAYellow» и т.д.).
• Анализ результатов амплификации ДНК ВКО.
• Для первой группы тестов: выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Red. В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич.фон (включена по умолчанию). Включить кнопку Коррект.уклона, затем включить кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии - в меню Вычисление Ct ввести в текстовом поле Порог значение 0,07. В таблице результатов по каналу Red будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Количественные результаты – CyclingA. Red» под окном графиков).
• Для второй группы тестов («дуплексов»): выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Orange. В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич.фон (включена по умолчанию). Включить в меню над графиками кнопку Коррект.уклона, затем включить кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии - в меню Вычисление Ct ввести в текстовом поле Порог значение 0,07. В таблице результатов по каналу Orange будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Количественные результаты – CyclingA. Orange» под окном графиков).

Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу со значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.
1.2 Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов.
Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:

• Выбрать в главном меню значок меню Анализ, в ниспадающем меню выбрать вкладку Количественный и нужный канал.
• Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по данному каналу.
• В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич. фон (включена по умолчанию), кнопка Коррект. уклонадолжна быть выключена или включена в соответствии с табл. 27 для данного канала (включена – для канала Crimson, выключена – для всех остальных). Включить кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение, указанное в табл. 27 для данного канала.
• Задать уровень пороговой линии: в меню Вычисление Ctввести в текстовом поле Порог значение 0,1.
• В таблице результатов по данному каналу будут указаны значения пороговых циклов Ct для каждой пробы (окно Количественные Результаты под окном графиков). Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу со значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

Таблица 27

Параметры анализа результатов по различным каналам при использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Канал детекции	Порог	Устранение выбросов	Коррект. уклона
Green	0,1	0	выключена
Yellow	0,1	5	выключена
Orange	0,1	5	выключена
Crimson	0,1	5	выключена
Red	0,07	5	включена

• Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма отсутствует значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО (каналу Red для тестов первой группы, каналу Orange - для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации ДНК анализируемых микроорганизмовне определено значение порогового цикла Ct и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
3. Для автоматизированного учета результатов некоторых тестов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп. 1-3, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 28 и 29).

Таблица 28

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

При использовании наборов группы 1
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Ct по каналам Green, Yellow, Orange и Crimson (если используется)	Ct по каналу Red
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение < 33
При использовании наборов группы 2
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Сt по каналам Green, Yellow	Сt по каналу Orange
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение < 33

Таблица 29

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля (ПКО)

Набор (тест), группа 1	Граничное значение Ct по каналу
	Green	Yellow	Orange	Crimson	Red
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium/ T.vaginalis	35	35	35	33	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium/ M.hominis	35	35	35	33	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium	30	33	33	-	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	30	33	33	-	33
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	33	30	33	-	33
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	33	33	33	-	33
Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»
U. parvum / U. Urealyticum	33	33	33	-	-
HSV –typing	33	30	33	-	-
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	33	33	33	-	-
HSV / CMV	30	30	33	-	-

 

Пример полученных результатов:
Результаты, полученные с использованием набора «АмплиСенс® C.trachomatis/ Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»


- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу Red (канал для ВКО) менее 33. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных значений. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образце 2 обнаружены ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу Green (здесь – Chlamydia trachomatis), и ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу Yellow (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу Yellow (здесь – Ureaplasma spp.), и по каналу Orange (здесь - Mycoplasma hominis).
- В образце 7 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу Yellow (здесь – Ureaplasma spp.).
- Для всех образцов, кроме образца 5, по каналу Red определены значения Ct менее 33.
- В образцах 1, 4 и 6 не обнаружены ДНК ни одного из выявляемых микроорганизмов
- Для образца 5 получен невалидный результат (отсутствуют значения Ct по всем каналам), требуется повторение анализа этого образца.

В2. Анализ результатов при использовании программы для «Rotor-Gene» 3000 и программы «Rotor-Gene» 6000 (или «Rotor-Gene Q») с англоязычным интерфейсом
Далее по тексту термины, соответствующие разным моделям приборов, указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для прибора «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» (если термины совпадают для разных моделей прибора, то указан один термин).
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам – по каналу FAM/Green регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма, по каналу JOE/Yellow регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

• Выбрать в главном меню значок меню Analysis, в ниспадающем меню выбрать вкладку Quantitationи выбрать в списке нужный канал. Выполнить операцию для данных канала FAM/Green, выбрав в поле «CyclingAFAM»/«CyclingAGreen», затем для данных канала JOE/Yellow, выбрав в поле «CyclingAJOE»/«CyclingAYellow».
• Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, регистрируемых по каналу JOE/Yellow.

2.1 Выбрать график нормализованных кривых флуоресценции по каналу JOE/Yellow.
2.2 В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube (включена по умолчанию). Включить в меню над графиками кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %).
2.3 Задать уровень пороговой линии: в меню CTCalculation ввести в текстовом поле Threshold значение 0,1.
2.4 В таблице результатов по каналуJOE/Yellow будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Quant. Resultes – Cycling A. JOE»/«Quant. Resultes – CyclingA. Yellow» под окном графиков).

• Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК микроорганизма, регистрируемых по каналу FAM/Green.

3.1 Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу FAM/Green.
3.2 В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube (включена по умолчанию). Кнопка Коррект. уклонадолжна быть выключена или включена в соответствии c табл. 30 для используемого набора реагентов. Включить кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение, указанное в табл. 30 для используемого набора реагентов.
3.3 Задать уровень пороговой линии: в меню CTCalculation ввести в текстовом поле Threshold значение 0,1.

3.4 В таблице результатов по каналуFAM/Green будут указаны значения порогового цикла Ct для каждого образца (окно «Quant. Resultes – Cycling A FAM»/«Quant. Resultes – Cycling A. Green» под окном графиков).

Таблица 30

Параметры анализа результатов по каналу FAM/Green

Наименование набора реагентов	Threshold	More Settings/ Outlier Removal	Slope Correct
Chlamydia trachomatis	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae-скрин	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae-тест	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae	0,1	0	выключена
Mycoplasma genitalium	0,1	0	выключена
Ureaplasma species	0,1	0	выключена
Mycoplasma hominis	0,1	0	выключена
HSVI, II	0,1	0	выключена
CMV	0,1	0	выключена
Gardnerella vaginalis	0,1	0	выключена
Treponema pallidum	0,1	5	включена
Trichomonas vaginalis	0,1	5	включена
Candida albicans	0,1	0	выключена

1. Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green определено значение порогового цикла Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green не определено (отсутствует) значение Ct (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение Ct, не превышающее граничного значения 30.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green не определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу JOE/Yellow значение Ctтакже отсутствует или превышает 30. В этом случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК..
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 31 и 32).

Таблица 31

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Ct
		по каналу FAM/Green	по каналу для флуорофора JOE/Yellow
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение <30
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение <30

Таблица 32

Граничные значения порогового цикла по каналу Green для положительного контроля

Наименование ПЦР-комплекта-FRT	Граничное значение Сt по каналу Green для «К+»
Chlamydia trachomatis	30
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	33
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae(1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагментов ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в табл. 20, согласно инструкции по его применению (каналы FAM/Green, или JOE/Yellow, или ROX/Orange, или Crimson). Результаты амплификации ДНК ВКО регистрируются при использовании наборов первой группы - по каналу Cy5/Red, а при использовании наборов второй группы («дуплексов») - по каналу ROX/Orange.
Результаты интерпретируются на основании данных, полученных по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО, согласно табл. 20 (раздел «Анализ и интерпретация результатов»).
1. Чтобы проанализировать данные по определенному каналу, нужно выбрать в главном меню значок меню Analysis, в ниспадающем меню выбрать вкладку Quantitationи необходимый канал (например, канал FAM/Green - «CyclingAFAM»/«CyclingAGreen», канал JOE/Yellow - «CyclingAJOE»/«CyclingAYellow» и т.д.).
2. Анализ результатов амплификации ДНК ВКО.
2.1 Для первой группы тестов: выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Cy5/Red. В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube(включена по умолчанию). Включить кнопку SlopeCorrect, затем включить кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии – в меню CTCalculation ввести в текстовом поле Threshold значение 0,07. В таблице результатов по каналу Cy5/Redбудут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Quant. Results – Cycling A. Cy5»/«Quant. Results – Cycling A. Red» под окном графиков).
2.2 Для второй группы тестов («дуплексов»): выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу ROX/Orange. В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube(включена по умолчанию). Включить в меню над графиками кнопку SlopeCorrect, затем включить кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии – в меню CTCalculation ввести в текстовом поле Порог значение 0,1. В таблице результатов по каналу ROX/Orangeбудут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно«Quant. Results – Cycling A. ROX»/«Quant. Results – Cycling A. Orange» под окном графиков).
3. Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК микроорганизмов.
Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:
3.1 Выбрать в главном меню значок меню Analysis, в ниспадающем меню выбрать вкладку Quantitationи выбрать в списке нужный канал.
3.2 Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по данному каналу.
3.3 В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube (включена по умолчанию). Кнопка SlopeCorrectдолжна быть выключена или включена в соответствии с указанным в табл. 33 вариантом для данного канала (включена – для канала Crimson, выключена – для всех остальных). Включить кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение, указанное в табл. 33 для данного канала.
3.4 Задать уровень пороговой линии: – в меню CTCalculationввести в текстовом поле Threshold значение 0,1.
3.5 В таблице результатов по данному каналу будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно Quant. Results под окном графиков).
Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу со значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

Таблица 33

Параметры анализа результатов по различным каналам при использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Канал детекции	Threshold	More Settings/ Outlier Removal	Slope Correct
FAM/Green	0,1	0	выключена
JOE/Yellow	0,1	5	выключена
ROX/Orange	0,1	5	выключена
Crimson (если используется)	0,1	5	выключена
Cy5/Red	0,07	5	включена

4. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма отсутствует значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО (каналу Сy5/Red для тестов первой группы, каналу ROX/Orange для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации результатов амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмане определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
5. Для автоматизированного учета результатов некоторых тестов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <(сокращенное название набора)> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп.1-2, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 34 и 35).

Таблица 34

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

При использовании наборов для выявления 3 или 4 микроорганизмов (группа 1)
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Ct по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange и Crimson (если используется)	Ct по каналу Cy5/Red
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение < 33
При использовании наборов для выявления 2 микроорганизмов (группа 2)
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение < 33

Таблица 35

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля

Набор (тест), группа 1		Граничное значение Ct по каналу
	FAM/Green		JOE/Yellow	ROX/Orange	Cy5/Red	Crimson
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium/ T.vaginalis	35		35	35	33	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium/ M.hominis	35		35	35	33	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium	30		33	33	33	-
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	30		33	33	33	-
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	33		30	33	33	-
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	33		33	33	33	-
Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»
U. parvum / U. Urealyticum	33		33	33	-	-
HSV-typing	33		30	33	-	-
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	33		33	33	-	-
HSV / CMV	30		30	33	-	-

Пример полученных результатов:
Результаты, полученные с использованием набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу Cy5/Red (канал для ВКО) менее 33. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных значений. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образце 2 обнаружены ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу FAM/Green (здесь – Chlamydia trachomatis), и ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу Yellow (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу JOE/Yellow (здесь – Ureaplasma spp.) и по каналу ROX/Orange (здесь - Mycoplasma hominis).
- В образце 7 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу JOE/Yellow (здесь – Ureaplasma spp.).
- Для всех образцов, кроме 5-го, по каналу Red определены значения Ct менее 33.
- Для образца 5 получен невалидный результат - отсутствуют значения Ct по всем каналам.

- В образцах 1, 4 и 6 не обнаружены ДНК ни одного из выявляемых микроорганизмов.

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «iQ iCycler» или «iQ5»

• Назначить для выполнения универсальную программу амплификации и детекции «АмплиСенс-1» (табл. 36).

Таблица 36

Программа «АмплиСенс-1» для приборов «iQ iCycler» или «iQ5»

Цикл	Температура, °С	Время	Кол-во циклов
1	95	15 мин	1
2	95	5 с	5
	60	20 с
	72	15 с
3	95	5 с	40
	60	30 с *детекция флуоресц.сигнала
	72	15 с

Для этого выбрать или создать эту программу в модуле Protocol (ViewProtocolsдля«iQ iCycler»).Для«iQ iCycler» назначить программу к выполнению, нажав кнопку RunwithselectedPlateSetup.
Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения амплификации и детекции при использовании комплектов реагентов «ПЦР-комплект» производства ФГУН ЦНИИЭ для выявления ДНК возбудителей ИППП. Поэтому можно одновременно в одном приборе проводить все эти тесты или любое их сочетание, включая все тесты для выявления и генотипирования вирусов папилломы человека (ВПЧ ВКР) с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» производства ФГУН ЦНИИЭ.
ВНИМАНИЕ! Для прибора «iQ iCycler» не рекомендуется одновременно выполнять амплификацию и детекцию с использованием наборов в формате «МУЛЬТИПРАЙМ» и наборов для выявления одного микроорганизма (т.е. тесты, в которых используются разные комбинации детектируемых каналов). Если требуется выполнять такие тесты одновременно, то необходимо при запуске выбрать для измерения факторов лунок вариант External Well Factors Plate и использовать для процедуры запуска набор пробирок со специальным раствором «External Well Factor Solution» (производства «Bio-Rad»).
ВНИМАНИЕ! Для прибора «iQ iCycler» необходимо проверить, чтобы протокол dynamicwf.tmo соответствовал стандартному, как показано на рисунке. Если этот протокол был изменен и не соответствует указанному, его необходимо исправить.
Протокол dynamicwf.tmo для прибора « iQ iCycler»:

• Задать схему планшета – расположение пробирок в модуле и детекцию флуоресцентного сигнала во всех пробирках по нужным каналам в окне Edit PlateSetupмодуля Workshop. При использовании наборов реагентов для выявления одного микроорганизма назначить детекцию по каналам FAM и HEX. При использовании наборов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» назначить детекцию по каналам FAM, HEX, ROX и Cy5. Сохранить схему планшета. Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.
• Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне SelectedPlateSetupмодуля Workshopнажать кнопку CreateNew или Edit. Редактировать схему планшета в режиме WholePlateloading. Чтобы включить второй флуорофор, необходимо использовать пиктограмму над схемой.Задать объем реакции (SampleVolume): 30 мкл, тип крышек (SealType): DomedCap, тип пробирок (VesselType): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&ExitPlateEditing.
• Для прибора «iQ iCycler» отредактировать схему планшета в окне Edit PlateSetup модуля Workshop и назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.
• При работе с «ПЦР-комплектами» вариант FRT (с использованием прослойки воска для горячего старта) перейти к пункту 4. При работе с «ПЦР-комплектами» вариант FRT-100 F и FRT-1000 F (с использованием химически модифицированной Taq-полимеразы – TaqF) поставить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора.
• Запустить выполнение выбранной программы «АмплиСенс-1» с заданной схемой планшета.

- Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы анализа следует проверить правильность выбранного протокола (SelectedProtocol) и схемы планшета (SelectedPlateSetup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Use PersistentWellFactors(предлагается по умолчанию).
- Для прибора «iQ iCycler» перед запуском выполнения программы в окне RunPrep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета. Выбрать под строкой Selectwellfactorsource вариант ExperimentalPlate(предлагается по умолчанию) для измерения факторов лунок (cм. примечание в п.1).Задать объем реакционной смеси – 30 мкл. Для запуска нажать кнопку Run.

• При работе с ПЦР-комплектами вариант FRT-100F и FRT-1000 F перейти к пункту 6.

При работе с ПЦР-комплектами вариант FRT (с использованием прослойки воска для горячего старта) после того, как температура реакционного блока достигнет 95 °С, нажать кнопку Pause, открыть крышку и поместить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора и нажать кнопку Resume Run для прибора «iQ5» (кнопку Continue Running Protocol для «iQ iCycler»).

• После окончания выполнения программы можно приступить к анализу результатов.
• По окончании работы с прибором необходимо закрыть программу и выключить прибор (амплификатор и блок оптической системы).

Анализ результатов, полученных при использовании приборов «iQ5» или «iQ iCycler»

Полученные данные интерпретируются с помощью программного обеспечения прибора «iQ5» или «iQ iCycler». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения графика флуоресценции данного образца с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
- по каналу HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

• Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма.
• Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM (для «iQ iCycler» выбрать значок канала FAM-490 в окне SelectaReporter). При этом должен быть выбран режим анализа данных PCRBaseLineSubtractedCurveFit(выбирается по умолчанию).
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

Чтобы выделить график образца «К+» (или другого желаемого образца), можно воспользоваться кнопкой DisplayWells (Selectwells), либо установить курсор на графике этого образца и сделать двойной щелчок.

• Для прибора «iQ5»: чтобы установить уровень пороговой линии, необходимо либо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать меню BaselineThreshold(в ниспадающем меню, вызываемом щелчком правой кнопки мыши по окну графиков флуоресценции), затем выбрать опцию UserDefinedи ввести нужное значение в текстовом поле ThresholdPosition. Чтобы вывести на экран полную таблицу результатов, нажать кнопку Results.
• Для прибора «iQ iCycler»: чтобы изменить уровень пороговой линии, необходимо либо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать опцию UserDefinedи ввести нужное значение в текстовом поле ThresholdPosition. После этого нажать кнопку RecalculateThresholdCycles.

Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать также при последующих анализах результатов с помощью данного набора при условии, что не производилась новая калибровка прибора.

• Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, регистрируемых по каналу HEX.
  Выполнить аналогичную операцию для данных по каналу HEX (для «iQ iCycler» выбрать значок канала HEX-530 в окне SelectaReporter). При этом должен быть выбран режим анализа данных PCRBaseLineSubtractedCurveFit(выбирается по умолчанию). Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать также при анализе результатов амплификации ВКО в других тестах, выполненных с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) для выявления ДНК возбудителей ИППП. Тот же уровень порога по каналу HEX можно использовать и при последующих анализах с помощью данного набора при условии, что не производилась новая калибровка прибора.

• Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице пороговых циклов по каналу FAM определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данного образца должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице в пороговых циклов по каналу FAM в графе Ct указывается значение N/A (отсутствует пересечение графика флуоресценции с пороговой линией), а в таблице пороговых циклов по каналу HEX для него определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы отсутствует (не определено) значение порогового цикла Ct (т.е. указано N/A) по каналу FAM и по каналу HEX значение Ctтакже отсутствует (N/A) или превышает 33. В этом случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 37 и 38).

 

 

Таблица 37

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
		по каналу FAM	по каналу HEX
В-	Экстракция ДНК	N/A (отсутствует)	Определено значение <33
К-	ПЦР	N/A (отсутствует)	N/A (отсутствует)
K+	ПЦР	Определено значение <граничного	Определено значение <33

Таблица 38

Граничные значения порогового цикла по каналу FAM для положительного контроля

Наименование набора реагентов	Граничное значение Сt по каналу FAM для «К+»
Chlamydia trachomatis	33
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	36
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

Пример полученных результатов для прибора «iQ5»:

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу HEX (канал для ВКО) менее 33. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по каналу FAM не превышает граничного значения. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 1, 4 и 5 обнаружена ДНК анализируемого микроорганизма.
- Во всех образцах, кроме образца 3, определено значение Ct по каналу HEX, не превышающее граничного значения 33.
- В образцах 2 и 6 не обнаружена ДНК анализируемого микроорганизма.
- Для образца 3 получен невалидный результат – отсутствуют значения Ct по обоим каналам, требуется повторение анализа этого образца.
Пример полученных результатов для прибора «iQ iCycler»:

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу HEX (канал для ВКО) менее 33. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по каналу FAM не превышает граничного значения. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В пробе 10 (B3) обнаружена ДНК анализируемого микроорганизма;
- В пробах 9, 11-15 не обнаружена ДНК микроорганизма.

При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагмента ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в инструкции по его применению и в табл. 20 (каналы FAM, или HEX (для флуорофора JOE), или ROX). Результаты амплификации ДНК ВКО при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов регистрируются по каналу Cy5, а при использовании наборов для выявления двух микроорганизмов («дуплексов») - по каналу ROX.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия значений пороговых циклов Ct по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО, согласно табл. 20 (раздел «Анализ и интерпретация результатов»).

• Анализ результатов амплификации ДНК ВКО.
• Выбрать в окне модуля анализа данные по каналу, назначенному для ВКО: при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов – канал Cy5 (для «iQ iCycler» выбрать значок канала Cy5-635 в окне SelectaReporter), при использовании наборов длявыявления двух микроорганизмов («дуплексов») канал ROX (для «iQ iCycler» выбрать значок канала ROX-575 в окне SelectaReporter). При этом должен быть выбран режим анализа данных PCRBaseLineSubtractedCurveFit(выбирается по умолчанию).
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

Чтобы выделить график образца «К+» (или другого желаемого образца), можно воспользоваться кнопкой DisplayWells (Selectwells), либо установить курсор на графике этого образца и сделать двойной щелчок.

• Для прибора «iQ5»: чтобы установить уровень пороговой линии, нужно либо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать меню BaselineThreshold(в ниспадающем меню, вызываемом щелчком правой кнопки мыши по окну графиков флуоресценции), затем выбрать опцию UserDefinedи ввести нужное значение в текстовом поле ThresholdPosition. Чтобы вывести на экран полную таблицу результатов, нажать кнопку Results.
• Для прибора «iQ iCycler»: чтобы изменить уровень пороговой линии, нужно либо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать опцию UserDefinedи ввести нужное значение в текстовом поле ThresholdPosition. После этого нажать кнопку RecalculateThresholdCycles.

Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать также при при последующих анализах результатов с помощью данного набора при условии, что не производилась новая калибровка прибора.

• Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК микроорганизмов.

Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:

• Выбрать в окне модуля анализа соответствующий канал (для «iQ iCycler» выбрать значок канала в окне SelectaReporter). При этом должен быть выбран режим анализа данных PCRBaseLineSubtractedCurveFit(выбирается по умолчанию).
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.
• Для удобства интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу со значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

3. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма отсутствует значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО (каналу Сy5 для тестов первой группы, каналу ROX для тестов второй группы), определено значение Ct, не превышающее граничного значения 36.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмовне определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 36. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца начиная с этапа экстракции ДНК.
3. Для автоматизированного учета результатов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп. 1-2, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 39 и 40).

Таблица 39

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
		по каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации амплификации ДНК ВКО (Cy5 или ROX)
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 36
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение < 36

Таблица 40

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля

Набор (тест)	Граничное значение Ct по каналу
	FAM	HEX	ROX
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium	33	36	36
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.hominis	33	36	36
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium	36	33	36
C.albicans/ C.glabrata/C. krusei	36	36	36
U. parvum/ U. Urealyticum	36	36	36
HSV-typing	36	33	36
T.vaginalis/ N.gonorrhoeae	36	36	36
HSV/ CMV	33	33	36

 

Пример результатов, полученных для прибора «iQ 5» при использовании набора реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»:

Результаты, полученные с использованием набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct<36 по каналу Cy5 (канал для ВКО). Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- Для всех образцов, кроме образца 5, по каналу Сy5 определены значения Ct менее 36
- В образце 2 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются соответственно по каналу FAM (здесь – Chlamydia trachomatis), и - по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.).
- В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются соответственно по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.), и - по каналу ROX (здесь - Mycoplasma hominis).
- В образце 4 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
- Для образца 5 получен невалидный результат - отсутствуют значения Ct по всем каналам.

- В образцах 1, 5 и 6 не обнаружены ДНК ни одного из анализируемых микроорганизмов.

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании прибора «ДТ-96»

А. Создание шаблона теста
Выбрать меню Tест, затем Создать/Редактировать тест. В открывшемся окне выбрать Создать новый тест. Задать (выбрать) следующие параметры теста:

• Тип – Качественный, Метод – Пороговый (Ct);
• Объем рабочей смеси в пробирке - 30 мкл;
• Флуорофоры: FAM, HEX, ROX – Cпецифика, Cy5 – ВКО;
• Программа амплификации – AmpliSens-1 (отредактированная в соответствии с табл. 41):

Таблица 41

Программа амплификации AmpliSens-1

Цикл	Температура, °С	Время	Кол-во циклов
1	95	15 мин	1
2	95	5 с	5
	60	20 с
	72	15 с
3	95	5 с	40
	60	30 с *детекция флуоресц.сигнала
	72	15 с

Нажать кнопку OK для сохранения теста.

Б. Проведение амплификации и детекции с использованием шаблона теста

• В меню Протокол нажать кнопку Добавить тест, задать количество исследуемых образцов и контролей («К+» и «К-»).
• Задать схему расположения образцов в реакционном блоке, указав для каждого образца его идентификатор. Нажать кнопку Применить.
• При использовании только наборов реагентов для выявления одного микроорганизма достаточно назначить детекцию по каналам FAM – Специфика и HEX – ВКО. Можно отключить детекцию по другим каналам (ROX, Cy5), указав для них тип флуорофора - Отсутствует.
• Открыть реакционный блок с помощью кнопки Открыть блок и поставить реакционные пробирки в ячейки блока в соответствии с предварительно заданной в протоколе схемой расположения пробирок. Закрыть блок с помощью соответствующей кнопки.
• В меню Запуск программы амплификации проверить правильность выбранной программы амплификации (AmpliSens-1) и объема реакционной смеси (30 мкл), заданных в шаблоне теста. Запустить выполнение программы амплификации и детекции, нажав кнопку Запуск программы.

В. Анализ результатов, полученных при использовании прибора «ДТ-96»

Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения прибора «ДТ-96». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции данного образца с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
- по каналу HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

• Выбрать в выпадающем списке Тип анализа пункт Качественный.
• Выбрать Метод – Пороговый (Сt)
• Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма.
  3.1 Выбрать канал FAM в списке выбора оптического канала.

3.2 Установить пороговую линию на 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» в последнем цикле амплификации. При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
Чтобы установить пороговую линию необходимо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши. Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца), можно выделить данный образец в окне Результаты.

• Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК ВКО.

Выполнить аналогичные операции для данных по каналу HEX.

• Выбрать канал HEX в списке Выбор оптического канала.
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации.

5. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM определено значение Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должен пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM не определено (отсутствует) значение порогового цикла Сt (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу HEX определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM не определено значение порогового цикла Ct и в таблице результатов по каналу HEX значение Ctтакже отсутствует или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 42 и 43).

Таблица 42

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
		по каналу FAM	по каналу HEX
B-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение <33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение <33

Таблица 43

Граничные значения порогового цикла по каналу FAM для положительного контроля

Наименование набора реагентов	Граничное значение Сt по каналу FAM для «К+»
Chlamydia trachomatis	33
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	36
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

При использовании наборов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагмента ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в табл. 20 и в инструкции по его применению (каналы FAM, или HEX, или ROX). Результаты амплификации ДНК ВКО при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов регистрируются по каналу Cy5, а при использовании наборов для выявления двух микроорганизмов («дуплексов») - по каналу ROX.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия значений пороговых циклов Ct по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО, согласно табл. 20 (раздел «Анализ и интерпретация результатов»).

• Выбрать в выпадающем списке Тип анализа пункт Ct(Cp) для всех каналов.
• Выбрать Метод – Пороговый (Сt).
• Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов.

Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:

• Выбрать нужный канал в списке выбора оптического канала.
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
• Чтобы установить пороговую линию, необходимо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши. Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца), нужно выделить данный образец в окне Результаты.
• Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу с полученными значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

4. Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК ВКО.

• Выбрать в списке канал, назначенный для ВКО: при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов – канал Cy5, при использовании наборов длявыявления двух микроорганизмов («дуплексов») – канал ROX.
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации. При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
• Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу с полученными значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

5. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должен пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма не определено (отсутствует) значение порогового цикла Сt (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для ВКО (канал Сy5 для тестов первой группы, канал ROX для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 36.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмане определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 36. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
6. Для автоматизированного учета результатов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп.1-4, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.

Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 44 и 45)

Таблица 44

Результаты контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
		по каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК ВКО (Cy5 или ROX)
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 36
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение < 36

Таблица 45

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля ПЦР

Набор (тест)	Граничное значение Ct по каналу
	FAM	HEX	ROX
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium	33	36	36
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	33	36	36
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	36	33	36
C.albicans/ C.glabrata/ C. Krusei	36	36	36
U. parvum / U. Urealyticum	36	36	36
HSV –typing	36	33	36
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	36	36	36
HSV / CMV	33	33	36

Пример результатов, полученных на приборе «ДТ-96»:
Результаты, полученные при использовании набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-»
и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct<36 по каналу Cy5 (канал для ВКО). Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 6 и 7 не обнаружены ДНК ни одного из микроорганизмов, по каналу Сy5 определены значения Ct менее 36.
- В образце 1 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу FAM (здесь – Chlamydia trachomatis) и по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 4 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются. cоответственно, по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.) и по каналу ROX (здесь – Mycoplasma hominis).
- Для образца 5 получен невалидный результат – отсутствуют значения Ct по всем каналам.

 

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «Mx3000P» или «Mx3005P»

• Задать схему планшета – расположение пробирок в модуле и детекцию флуоресцентного сигнала во всех пробирках по используемым каналам в окне PlateSetup. Все образцы обозначить значком Unknown, отметить галочкой имена флуорофоров, которые нужно детектировать, нажать кнопку Showwellnames и ввести имя образца в каждую ячейку. При использовании наборов реагентов для выявления одного микроорганизма назначить детекцию по каналам FAM и JOE. При использовании наборов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» назначить детекцию по каналам FAM, JOE, ROX и Cy5.
• Назначить для выполнения на амплификаторе «Mx3000P» или «Mx3005P» универсальную программу амплификации и детекции «АмплиСенс-1 Mx». Для этого выбрать или создать эту программу в модуле ThermalProfileSetup, затем сохранить файл с выбранной программойи схемой планшета, и запустить выполнение программы, нажав кнопку Run.

Программа «АмплиСенс-1»:
Segment 1– 1 Cycle: 95 °С – 15 мин
Segment 2 – 5 Cycles: 95 °С – 5 с/ 60 °С – 20 с/ 72 °С – 15 с
Segment 3 – 40 Cycles: 95 °С – 5 с/ 60 °С – 30 с */ 72 °С – 15 с
* - детекция флуоресценции на втором шаге (60 °С) второго блока циклирования (Segment 3).
С использованием универсальной программы «Амплисенс-1» можно одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» производства ФГУН ЦНИИЭ, включая все тесты для выявления и генотипирования вирусов папилломы человека.

• Поставить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора.
• Рекомендуется перед стартом включить (отметить галочкой) опцию выключения лампы после окончания выполнения программы.
• После окончания программы можно приступить к учету результатов.
• По окончании работы с прибором необходимо закрыть программу и выключить прибор.

Анализ результатов, полученных при использовании приборов «Mx3000P» или «Mx3005P»

Полученные данные анализируются с помощью программного обеспечения прибора «Mx3000P» или «Mx3005P». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции данного образца с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
- по каналу JOE регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.
1. Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма.
Выбрать в окне Results / Amplification Plots модуля Analysis данные по каналу FAM. Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.
Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца) в окне AnalysisSelection/Setup, выберите ячейку, соответствующую этому образцу, и снова переключитесь в окно Results.
Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать и при учете результатов амплификации ДНК данного возбудителя при последующих анализах с помощью данного набора.
2. Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, регистрируемых по каналу JOE.
Выполнить аналогичную операцию для данных канала JOE. Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.
Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать и при анализе результатов амплификации ВКО в других тестах для выявления ДНК одного из возбудителей ИППП, выполненных с помощью наборов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ. Тот же уровень порога по каналу JOE можно использовать и при последующих анализах с помощью данного набора.
3. Для получения суммарной таблицы результатов (пороговых циклов) включите в окне Results / AmplificationPlots данные по обоим каналам и выберите в меню в списке опций Areatoanalyze опцию TextReport. Полученную таблицу результатов можно экспортировать в Excel (для этого щелчком правой кнопки мыши вызвать меню и выбрать в нем пункт ExportTextReporttoExcel).
4. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице пороговых циклов по каналу FAM (при выбранном значке канала FAM-490 в окне SelectaReporter) для этого образца определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данного образца должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице в пороговых циклов по каналу FAM в графе Ct для него указывается значение N/A (не детектируется пересечение кривой флуоресценции с пороговой линией), а в таблице пороговых циклов по каналу JOE для него определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено значение порогового цикла Ct, т.е. указано N/A, по каналу FAM и по каналу JOE значение Ctтакже отсутствует (N/A) или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 46 и 47).

Таблица 46

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
		по каналу FAM	по каналу JOE
В-	Экстракция ДНК	N/A (отсутствует)	Определено значение <33
К-	ПЦР	N/A (отсутствует)	N/A (отсутствует)
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение <33

Таблица 47

Граничные значения порогового цикла по каналу FAM для положительного контроля ПЦР

Наименование набора реагентов	Граничное значение Сt по каналу FAM для «К+»
Chlamydia trachomatis	33
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	36
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагмента ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в табл. 20 и в инструкции по его применению (каналы FAM, или JOE, или ROX). Результаты амплификации ДНК ВКО при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов регистрируются по каналу Cy5, а при использовании наборов для выявления двух микроорганизмов («дуплексов») – по каналу ROX.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия значений пороговых циклов Ct по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО, согласно табл. 20.

• Анализ результатов амплификации ДНК ВКО.
• Выбрать в окне Results/ AmplificationPlots модуля Analysis данные по каналу, назначенному для ДНК ВКО: канал Cy5 – при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов, канал ROX – при использовании наборов для выявления двух микроорганизмов («дуплексов»).
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца), выберите этот образец в списке результатов справа от окна AmplificationPlots и снова переключитесь в окно Results. Чтобы включить снова все анализируемые образцы, следует нажать кнопку Selectall справа внизу (под списком результатов)

• Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов.

Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:

• Выбрать нужный канал в окне Results / AmplificationPlots модуля Analysis.
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

3. Для получения суммарной таблицы результатов (пороговых циклов) по всем каналам включите в окне Results / AmplificationPlots данные по всем каналам и выберите в меню в списке опций Areatoanalyze опцию TextReport. Полученную таблицу результатов можно экспортировать в Excel (для этого щелчком правой кнопки мыши вызвать меню и выбрать в нем пункт ExportTextReporttoExcel).
4. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должен пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма не определено (отсутствует) значение порогового цикла Сt (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для ВКО (канал Сy5 для тестов первой группы, канал ROX для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 36.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмане определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 36. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
5. Для автоматизированного учета результатов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп. 1-3; полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.

Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 48 и 49).

 

Таблица 48

Результаты контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
		по каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации амплификации ДНК ВКО (Cy5 или ROX)
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 36
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение < 36

Таблица 49

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля ПЦР

Набор (тест)	Граничное значение Ct по каналу
	FAM	HEX	ROX
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium	33	36	36
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	33	36	36
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	36	33	36
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	36	36	36
U. parvum / U. Urealyticum	36	36	36
HSV –typing	36	33	36
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	36	36	36
HSV / CMV	36	36	36

Пример результатов, полученных при использовании прибора «Mx3000P»:
Результаты, полученные с применением набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» -- отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct<36 по каналу Cy5 (канал для ВКО). Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 2, 3 и 6 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу JOE (здесь – Ureaplasma spp.). В образце 3 также обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу ROX (здесь – Mycoplasma hominis)
- В образце 5 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу FAM (здесь – Chlamydia trachomatis), и - по каналу JOE (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образцах 1 и 4 не обнаружены ДНК выявляемых микроорганизмов. Значения Ct по каналу Сy5 (канал для ВКО) для них не превышают граничного значения 36.

Страница 3 - 3 из 3
Начало | Пред. | 1 2 3 | След. | Конец | Все