Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Меню

Категории

05.05.2010

Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ФГУН ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

Методические рекомендации

Исследование клинического материала
на наличие ДНК возбудителей ИППП и других
инфекций органов репродукции методом ПЦР
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Перечень наборов реагентов «АмплиСенс®» производства ФГУН ЦНИИЭ
для выявления ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Выявляемые микроорганизмы (возбудители инфекций)	Наборы реагентов
Бактериальные инфекции
*Chlamydia trachomatis*	«АмплиСенс® Chlamydia trachomatis-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Neisseria gonorrhoeae*	«АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-скрин-FL» «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-тест-FL» «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Treponema pallidum*	«АмплиСенс® Treponema pallidum-FL»
*Mycoplasma genitalium*	«АмплиСенс® Mycoplasma genitalium -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum*	«АмплиСенс® Ureaplasma spp.-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Mycoplasma hominis*	«АмплиСенс® Mycoplasma hominis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Gardnerella vaginalis*	«АмплиСенс® Gardnerella vaginalis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Вирусные инфекции – герпесвирусы
*HSV I, II*	«АмплиСенс® HSV I , II-FL» «АмплиСенс® HSV- typing-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*CMV*	«АмплиСенс® CMV -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Протозойные инфекции
*Trichomonas vaginalis*	«АмплиСенс® Trichomonas vaginalis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Грибковые инфекции
*Candida albicans*	«АмплиСенс® Candida albicans -FL»
Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei	Набор серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Одновременно выявляемые микроорганизмы	Наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp. / Mycoplasma genitalium	«АмплиСенс® C. trachomatis / Ureaplasma / M. genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp./ Mycoplasma hominis	«АмплиСенс® C. trachomatis / Ureaplasma / M. hominis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
*Neisseria gonorrhoeae /* *Chlamydia trachomatis /* *Mycoplasma genitalium /* *Trichomonas vaginalis*	«АмплиСенс® N.gonorrhoeae / C.trachomatis / M.genitalium / T.vaginalis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp. / Mycoplasma genitalium / *Mycoplasma hominis*	«АмплиСенс® C.trachomatis / Ureaplasma /M.genitalium / M.hominis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
*Neisseria gonorrhoeae /* *Chlamydia trachomatis /* *Mycoplasma genitalium /*	АмплиСенс® N.gonorrhoeae / C.trachomatis / M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
*HSV I / HSV II*	«АмплиСенс® HSV-typing -FL»
*Ureaplasma parvum / Ureaplasma urealyticum*	«АмплиСенс® U.parvum / U.urealyticum-FL» (выявление и дифференциация)
Trichomonas vaginalis / Neisseria gonorrhoeae	«АмплиСенс® T.vaginalis / N.gonorrhoeae -МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
*Chlamydia trachomatis /* *Ureaplasma spp.*	АмплиСенс® C.trachomatis / Ureaplasma -МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (FEP)
*Chlamydia trachomatis /* *Mycoplasma genitalium*	АмплиСенс® C.trachomatis / M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (FEP)
Candida albicans / Candida glabrata / Candida krusei /	«АмплиСенс® C.albicans / C.glabrata / C.krusei-FL»
*HSV / CMV*	«АмплиСенс® HSV / CMV-FL»

В настоящих методических рекомендациях применяются следующие сокращения и обозначения:

ВКО-FL	- внутренний контрольный образец для наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
ИППП	- инфекции, передаваемые половым путем
ОКО	- отрицательный контрольный образец
ПКО	- положительный контрольный образец
ПЦР	- полимеразная цепная реакция
ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора	- Федеральное государственное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
FEP	- флуоресцентная детекция по «конечной точке»
FRT	- флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
МУЛЬТИПРАЙМ	- серия наборов для одновременного выявления ДНК нескольких микроорганизмов в одной ПЦР

Выявление микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа: экстракцию (выделение) ДНК из образцов клинического материала, амплификацию фрагмента ДНК данного микроорганизма и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится либо непосредственно в ходе ПЦР (вариант FRT), либо после ее завершения (вариант FEP). Экстракция ДНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-FL), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами ДНК проводится реакция амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма при помощи специфичных к нему праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. К олигонуклеотидным зондам, специфичным к различным ДНК-мишеням, прикреплены различные флуоресцентные метки. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации каждой ДНК-мишени путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по соответствующему каналу.
Детекция флуоресцентного сигнала при использовании варианта FEP осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, а при использовании варианта FRT – непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». В обоих случаях детекция результатов ПЦР осуществляется без извлечения продуктов реакции из пробирок, что позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами ПЦР. Дополнительным преимуществом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией является возможность автоматизировать учет результатов анализа, снизить субъективизм в интерпретации результатов.
Преимуществом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией являются также широкие возможности проведения мультиплексного ПЦР-анализа, т.е. одновременное проведение амплификации и детекции нескольких ДНК-мишеней (ДНК нескольких микроорганизмов) с помощью одной реакции. При этом благодаря проведенной оптимизации сохраняется высокая чувствительность в отношении каждой из выявляемых ДНК-мишеней. Использование мультиплексной ПЦР позволяет повысить производительность выполнения анализа в три-четыре раза без увеличения приборной базы лаборатории.
Для мультиплексного ПЦР-анализа с гибридизационно-флуоресцентной детекцией предназначены наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ».

Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I – IV групп патогенности».
Исследование разделяется на три этапа и проводится в трех помещениях (ЗОНАХ):
В ЗОНЕ 1 проводится первичный разбор, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и предварительная обработка клинического материала.
В ЗОНЕ 2 проводится экстракция ДНК из клинического материала.
В ЗОНЕ 3 проводится подготовка пробирок для проведения ПЦР и проведение ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной детекции.

При работе всегда следует выполнять следующие требования:

Использовать наконечники с фильтрами для автоматических дозаторов. Для каждой процедуры использовать новый наконечник.
Следует рассматривать образцы как потенциально вызывающие инфекцию и хранить в биологическом кабинете в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
Уничтожать образцы и неиспользованные реактивы в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

ВНИМАНИЕ! При утилизации пробирок, содержащих продукты ПЦР после амплификации, недопустимо их открывание и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами амплификации лабораторной зоны, оборудования и реагентов.
Интерпретация результатов и внесение готовых результатов в журнал проводит аккредитованный врач-лаборант.
Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания.

Для взятия клинического материала:
Транспортная среда - «Транспортная среда с муколитиком (ТСМ)» (ТУ 9398-098-01897593-2009) или «Транспортная среда для мазков» (ТУ 9398-088-01897593-2009), или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (при работе с формами комплектации 1–3).
Для предобработки клинического материала и проведения экстракции ДНК из клинических образцов (ЗОНЫ 1-2):

Комплект реагентов для выделения ДНК - «ДНК-сорб-АМ» (ТУ 9398-036-01897593-2009) или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Бокс биологической безопасности (бокс абактериальной воздушной среды)
2 класса защиты (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).
Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).
Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, «Axygen», США).
Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
Отдельный халат и одноразовые перчатки.
Емкость с дезинфицирующим раствором.
Одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов.

Для проведения амплификации и флуоресцентной детекции (ЗОНА 3):

Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
Центрифуга/вортекс.
Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до 20 мкл, при работе с «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F – от 5 до 20 мкл и от 20 до 200 мкл).
Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл в штативах.
Штативы для микропробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с используемыми комплектами реагентов). Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных проб ДНК.
Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.1888-04.
Емкость для сброса наконечников.

При работе с «ПЦР-комплектом» вариант FEP:

Программируемый амплификатор (например, «Терцик» («ДНК-Технология», Россия), «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research», Австралия), «MAXYGENE» («Axygen», США), «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems») или аналогичные).
Флуоресцентный ПЦР-детектор (например, «AЛА-1/4» («BioSan», Латвия), «Джин» («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
Пластиковая пипетка для минерального масла (для работы с «ПЦР-комплектом» вариант FEP-1000).

При работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT:
8. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» – при работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT (например, «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия), «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия), «iQ5» («Bio-Rad», США), «Mx3000P» («Stratagene», США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
9. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл – при работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT-100 F:
а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой крышкой (например, «Axygen», США) – при использовании прибора планшетного типа;
б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой (например, «Axygen», США), или пробирки для ПЦР к «Rotor-Gene», объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (например, «Corbett Research», Австралия; «Qiagen», Германия) – при использовании прибора роторного типа.

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2008 г.
Материалом для исследования служат: соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, прямой кишки, ротоглотки; отделяемое конъюнктивы глаз, эрозивно-язвенных элементов слизистых и кожи; моча (первая порция мочи), секрет предстательной железы человека.

Для проведения анализа, как правило, используются следующие виды клинического материала:

У женщин: соскобное отделяемое слизистых оболочек цервикального канала, влагалища, уретры; моча.
У мужчин: соскобное отделяемое слизистой оболочки уретры, моча, секрет предстательной железы.
У детей: моча, отделяемое конъюнктивы глаз.

Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, рекомендованной ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Полученные образцы (кроме образцов мочи) можно транспортировать и хранить в следующих режимах:

при комнатной температуре – в течение 48 часов;
при температуре от 2 до 8 °С – в течение двух недель;
при температуре не выше мину 20 °С – в течение месяца;
при температуре не выше минус 68 °С – длительно.

Полученные образцы, помещенные в транспортную среду с муколитиком (ТСМ), можно транспортировать и хранить:

при комнатной температуре (от 18 до 25 °С) до 28 суток;
при температуре от 2 до 8 °С до 3 месяцев;
при температуре не выше минус 20 °С – длительно.

Допускается однократное замораживание-оттаивание клинических образцов.
Полученные образцы мочи можно транспортировать и хранить:

при комнатной температуре – в течение 6 часов;
при температуре от 2 до 8 °С – в течение суток;

Доставка клинических образцов осуществляется в специальном контейнере с охлаждающими элементами.
Для проведения исследования на наличие ДНК определенного микроорганизма анализируются следующие виды клинического материала:
- для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma spp.,U.parvum / U.urealyticum, Mycoplasma hominis–соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, образцы мочи, секрет предстательной железы человека.
- для выявления ДНК Chlamydia trachomatisи Neisseria gonorrhoeae возможно также исследовать отделяемое конъюнктивы глаз, соскобное отделяемое слизистых оболочек прямой кишки, ротоглотки.

для выявления ДНК HSVI и II типов, Treponema pallidum– соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, прямой кишки, ротовой полости, отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний) и эрозивно-язвенных поражений кожи и слизистых оболочек.
для выявления ДНК HSVI и II типов можно также исследовать цельную кровь и ликвор, отделяемое конъюнктивы глаз.
для выявления ДНК CMV – соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, моча, слюна и цельная кровь.
для выявления ДНКCandida albicans– соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, ротовой полости; моча.
для выявления ДНКGardnerella vaginalis– соскобное отделяемое слизистой оболочки влагалища.

При использовании секрета предстательной железы, цельной крови или ликвора для экстракции ДНК рекомендуется использовать комплект реагентов «ДНК-сорб-B».

ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

Экстракция (выделение) ДНК из исследуемых (клинических) образцов;
Проведение амплификации (вариант FEP) или амплификации с детекцией в режиме «реального времени» (вариант FRT) *.
Флуоресцентная детекция продуктов амплификации (вариант FEP).
Анализ и интерпретация результатов.

*) При использовании ПЦР-комплектов вариант FRT проводят ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», т.е. совмещают этапы амплификации и детекции продуктов амплификации. При использовании ПЦР-комплектов вариант FEP флуоресцентная детекция проводится отдельным этапом после завершения амплификации («по конечной точке»).

Для экстракции (выделения) ДНК используются наборы реагентов, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, в соответствии с инструкцией к используемому набору. Экстракция ДНК из каждого клинического образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца – ВКО-FL.
При использовании набора реагентов, включающего комплект «ДНК-сорб-АМ», для экстракции ДНК используется входящий в набор комплект «ДНК-сорб-АМ» (за исключением экстракции из образцов клинического материала, для которого рекомендуется использовать комплект «ДНК-сорб-B»).

Предварительная обработка образцов клинического материала
(требуется только для образцов мочи)
Взболтать флакон с мочой. Перенести 1 мл мочи в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл, используя отдельный наконечник с фильтром для каждого образца. Центрифугировать 5 мин при 10000 g (12 тыс об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf). При наличии большого количества солей ресуспендировать только верхний слой осадка солей в объеме 1 мл и затем снова центрифугировать. Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удалить надосадочную жидкость, не захватывая осадок и используя для каждого образца отдельный наконечник (без фильтра). К осадку добавить транспортную среду до конечного объема 0,2 мл. Тщательно перемешать содержимое пробирки на вортексе.
Предварительно обработанные образцы мочи (осадок мочи в транспортной среде) можно хранить

при температуре от 2 до 8 °С – в течение суток;
при температуре не выше минус 20 °С – в течение недели;
при температуре не выше минус 68 °С – длительно.

А. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-АМ»

Принцип метода экстракции
Клинический образец (клинический материал, помещенный в транспортную среду) обрабатывается лизирующим раствором в присутствии частиц силики – сорбента. В результате происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение ДНК. Растворенная ДНК в присутствии лизирующего раствора связывается с частицами сорбента, в то время как другие компоненты лизированного клинического материала остаются в растворе и удаляются при осаждении сорбента центрифугированием и последующей отмывкой. При добавлении раствора для элюции ДНК к сорбенту происходит переход ДНК с поверхности силики в раствор, который отделяется от частичек сорбента центрифугированием. В результате указанной процедуры получается высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность ПЦР-исследования.

Состав комплекта «ДНК-сорб-АМ»

*Реагент*	*Описание*	*Вариант 50*		*Вариант 100*
*Реагент*	*Описание*	*Объем (мл)*	*Кол-во*	*Объем (мл)*	*Кол-во*
Лизирующий раствор	Раствор, содержащий хаотропный агент	15	1 флакон	30	1 флакон
Отмывочный раствор	Раствор, содержащий этиловый спирт	50	1 флакон	100	1 флакон
Сорбент универсальный	Суспензия частиц силики	1,0	1 пробирка	1,0	2 пробирки
ТЕ-буфер для элюции ДНК	Буферный раствор для элюции ДНК	5,0	1 пробирка	5,0	2 пробирки

Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются следующие реагенты:

*Реагент*	*Описание*	*Вариант 50*		*Вариант 100*
*Реагент*	*Описание*	*Объем (мл)*	*Кол-во*	*Объем (мл)*	*Кол-во*
ВКО комплексный	Раствор, содержащий фрагменты ДНК ВКО (в составе генно-инженерных конструкций)	1,0	1 пробирка	1,0	1 пробирка
ВКО-FL	Раствор, содержащий фрагмент ДНК ВКО-FL (в составе генно-инженерных конструкций)	1,0	1 пробирка	1,0	1 пробирка
ОКО	Транспортная среда	1,2	1 пробирка	1,2	1 пробирка

Подготовка к проведению экстракции ДНК

Включить термостат и установить температуру 65 °С.
Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) следует прогреть, перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов (кристаллы могут образовываться на дне флакона).
Подготовить и расставить в штативе необходимое количество одноразовых стерильных полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл, промаркировать их.
Подготовить и расставить в штативе пробирки с клиническими образцами. Перед проведением процедуры экстракции нуклеиновых кислот осадить капли материала со стенок пробирки и внутренней части крышки центрифугированием (1500-3000 об/мин в течение 5 с), после чего аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе, избегая разбрызгивания и попадания материала на внутреннюю часть крышки.
При использовании первой порции мочи для исследования образцов провести предварительную обработку с целью получения образцов осадка мочи в транспортной среде, как описано в разделе выше.

Процедура экстракции ДНК

В подготовленные одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки внести по 10 мкл ВКО-комплексного или ВКО-FL в зависимости от метода детекции продуктов ПЦР (см. «Состав комплекта»). При использовании наборов реагентов с разными методами детекции допускается внесение двух препаратов внутреннего контрольного образца по 10 мкл каждого.
Ресуспендировать сорбент и внести в каждую пробирку по 20 мкл сорбента универсального, после чего внести по 300 мкл лизирующего раствора, используя наконечники с аэрозольным барьером.

Примечание. Если количество обрабатываемых клинических образцов составляет более 50 за рабочую смену, рекомендуется добавить весь объем сорбента и ВКО во флакон с лизирующим раствором (2 мл сорбента универсального и 1 мл ВКО на 30 мл лизирующего раствора). Полученную суспензию тщательно перемешать и внести по 330 мкл в подготовленные пробирки. Допускается хранение смеси не более 2 сут при комнатной температуре. Перед применением суспензию тщательно перемешать.

Внести по 100 мкл клинического образца, используя для каждой пробы отдельный наконечник с фильтром. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100 мкл ОКО.
Пробирки плотно закрыть, содержимое тщательно перемешать на вортексе и инкубировать 5 мин при 65 °С в термостате. После окончания инкубации содержимое повторно перемешать на вортексе и оставить при комнатной температуре на 2 мин.
Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 10 тыс об/мин в течение 30 с. Не захватывая сорбент, удалить надосадочную жидкость в колбу-ловушку с помощью вакуумного отсасывателя, используя для каждой пробы отдельный наконечник без фильтра.
Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.
Повторить п. 5.
Поместить пробирки в термостат с температурой 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента, при этом крышки пробирок должны быть открыты.
В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, используя наконечник с фильтром. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Поместить в термостат с температурой 65 °С на 5 мин. Допускается при необходимости увеличение объема элюции до 150 мкл.
Центрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Полученные пробы ДНК можно хранить в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С или в течение года при температуре не выше минус 16 °С.
При повторном исследовании проб, содержимое пробирок необходимо перемешать на вортексе и повторить центрифугирование в соответствии с п.10.

Б. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-B»

Принцип метода экстракции
Принцип метода экстракции при использовании комплекта реагентов «ДНК-сорб-B» соответствует описанному выше для методики экстракции с использованием комплекта «ДНК-сорб-АМ».
Состав комплекта «ДНК-сорб-B»

*Реагент*	*Описание*	*Вариант 50*		*Вариант 100*
*Реагент*	*Описание*	*Объем (мл)*	*Кол-во*	*Объем (мл)*	*Кол-во*
Лизирующий раствор	Раствор, содержащий хаотропный агент	15	1 флакон	30	1 флакон
Раствор для отмывки 1	Раствор, содержащий хаотропный агент и этиловый спирт	15	1 флакон	30	1 флакон
Раствор для отмывки 2	Раствор, содержащий этиловый спирт	50	1 флакон	100	1 флакон
Сорбент универсальный	Суспензия частиц силики	1,25	1 пробирка	1,25	2 пробирки
ТЕ-буфер для элюции ДНК	Буферный раствор для элюции ДНК	5,0	1 пробирка	5,0	2 пробирки

Подготовка к проведению экстракции ДНК

Включить термостат и установить температуру 65 °С.

Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) следует прогреть, перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.

Подготовить и расставить в штативе необходимое количество одноразовых стерильных полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл и промаркировать их.
Подготовить и расставить в штативе пробирки с клиническими образцами. Перед проведением процедуры экстракции нуклеиновых кислот осадить капли материала со стенок пробирки и внутренней части крышки центрифугированием (1500-3000 об/мин в течение 5 с), после чего аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе, избегая разбрызгивания и попадания материала на внутреннюю часть крышки.

Процедура экстракции ДНК

В подготовленные одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки внести по 10 мкл ВКО-комплексного или ВКО-FL в зависимости от метода детекции продуктов ПЦР. При использовании наборов реагентов с разными методами детекции допускается внесение двух препаратов внутреннего контрольного образца по 10 мкл каждого.
В каждую из подготовленных пробирок внести по 300 мкл лизирующего раствора.
В пробирки с лизирующим раствором и ВКО внести по 100 мкл клинического образца, используя наконечники с фильтром. В пробирку отрицательного контроля (ОК) выделения внести 100 мкл ОКО.
Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе, затем инкубировать 5 мин при температуре 65 °С. Центрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, центрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс об/мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.
Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин.
Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального.
Повторить п. 6.
Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального.
Осадить сорбент центрифугированием при 10 тыс об/мин в течение
30 с на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Повторить процедуру отмывки, следуя пп. 9-10, удалить надосадочную жидкость полностью.
Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5-10 мин. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
В пробирки внести по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать содержимое пробирок на вортексе. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
Центрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Полученные пробы ДНК можно хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение года при температуре не выше минус 16 °С.

Состав
«ПЦР-комплект» вариант FEP включает:

*Реагент*	*Описание*	*Объем,* *(мл)*	*Кол-во*
ПЦР-смесь-1-FL	Раствор, содержащий праймеры, дНТФ и олигонуклеотидные зонды	0,01	110 пробирок объемом 0,5 или 0,2 мл
ПЦР-смесь-2-FL-red	Буферный раствор, содержащих Taq-полимеразу, Mg2+	1,1	1 пробирка
ПЦР-смесь-Фон-red¹	Буферный раствор	0,6	1 пробирка
Минеральное масло для ПЦР²	Масло, препятствующее испарению ПЦР-смеси	4,0	1 флакон
ПКО комплексный	Раствор, содержащий специфические фрагменты ДНК анализируемых микроорганизмов (в составе генно-инженерных конструкций)	0,2	1 пробирка
ДНК-буфер	Буферный раствор	0,5	1 пробирка

Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли.

¹ Реагент используется при исследовании проб ДНК, выделенных с помощью наборов «ДНК-сорб-АМ» или «ДНК-сорб-B».
² Реагент используется при применении амплификаторов без термостатируемой крышки (например, «Терцик», «ДНК-Технология», Россия).

«ПЦР-комплект» вариант FEP-1000 включает:

*Реагент*	*Описание*	*Объем (мл)*	*Кол-во*
ПЦР-смесь-1-FL	Раствор, содержащий праймеры, дНТФ и олигонуклеотидные зонды	0,01	1100 пробирок объемом 0,5 мл
ПЦР-смесь-2-FL-red	Буферный раствор, содержащий Taq-полимеразу, Mg2+	5,5	2 флакона
ПЦР-смесь-Фон-re¹	Буферный раствор	2,5	1 флакон
Минеральное масло для ПЦР²	Масло, препятствующее испарению ПЦР-смеси	40	1 флакон
ПКО комплексный	Раствор, содержащий специфические фрагменты ДНК анализируемых микроорганизмов (в составе генно-инженерных конструкций)	1,0	1 пробирка
ДНК-буфер	Буферный раствор	0,5	2 пробирки

Комплект реагентов рассчитан на проведение 1100 реакций амплификации, включая контроли.

¹Реагент используется при исследовании проб ДНК, выделенных с помощью наборов «ДНК-сорб-АМ» или «ДНК-сорб-B».
²Реагент используется при применении амплификаторов без термостатируемой крышки (например, «Терцик», «ДНК-Технология», Россия).

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ

Общий объем реакционной смеси – 30 мкл, включая объем пробы ДНК – 10 мкл.

А. Подготовка пробирок для проведения амплификации
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FL для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.
В пробирки с ПЦР-смесью-1-FL на поверхность застывшего воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2-FL-red, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FL.
Сверху добавить каплю минерального масла для ПЦР (при использовании амплификатора без термостатируемой крышки).
Приготовить образец «Фон». Для этого в пробирку с ПЦР-смесью-1-FL на поверхность застывшего воска внести 20 мкл ПЦР-смеси-Фон-red. Сверху добавить каплю минерального масла для ПЦР (при использовании амплификатора без термостатируемой крышки).

ВНИМАНИЕ! Реагент ПЦР-смесь-Фон-red используется при исследовании проб ДНК, выделенных с помощью наборов «ДНК-сорб-АМ» или «ДНК-сорб-B». При использовании других наборов реагентов для экстракции ДНК, рекомендованных ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, необходимо следовать инструкции к используемому набору.

В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных путем экстракции из исследуемых или контрольных образцов.
Поставить контрольные реакции:

а) отрицательный контроль ПЦР (К-) – внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.
б) положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО комплексного.
в) отрицательный контроль экстракции ДНК (B-) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ОКО.
Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на центрифуге/вортексе (1-3 с).

Б. Проведение амплификации

Запустить на амплификаторе соответствующую программу термоциклирования «АмплиСенс-1-FEP» (см. табл. 1).
Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (режим паузы), поставить пробирки в ячейки амплификатора и нажать кнопку продолжения программы.

Таблица 1

Программа «АмплиСенс-1-FEP»

	«Терцик»			«GeneAmp PCR System 2700»			«Gradient Palm Cycler», «MAXYGEN»
Цикл	Температура, °С	Время	Кол-во циклов	Температура, °С	Время	Кол-во циклов	Температура, °С	Время	Кол-во циклов
0	95	Пауза		95	Пауза		95	Пауза
1	95	5 мин	1	95	5 мин	1	95	5 мин	1
2	95	2 с	35	95	20 с	20	95	2 с	24
	65	5 с		65	25 с		65	10 с
	72	5 с		72	30 с		72	10 с
3	95	2 с	9	95	20 с	24	95	2 с	20
	60	10 с		60	30 с		60	15 с
	72	5 с		72	30 с		72	10 с
4	95	2 с	1	95	20 с	1	95	2 с	1
4	60	10 с	1	60	30 с	1	60	15 с	1
5	10	Хранение		10	Хранение		10	Хранение

3. По окончании выполнения программы приступить к флуоресцентной детекции.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ПО «КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ»

Детекция проводится с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора (согласно инструкции к используемому прибору) путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по используемым каналам.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма проводится детекция флуоресцентного сигнала по двум каналам:

по каналу FAM (или аналогичному, в зависимости от модели прибора) регистрируется сигнал о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК возбудителя (выявляемого микроорганизма).
по каналу HEX (или аналогичному, в зависимости от модели прибора) регистрируется сигнал о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

Пороговые значения для настроек тестов, используемых при проведении детекции, указаны в табл. 2 и во вкладыше к используемому комплекту реагентов.

Таблица 2

Настройки тестов – пороговые значения при использовании наборов для выявления ДНК одного микроорганизма

Наименование теста	Порог отрицательного результата	Порог положительного результата
*Chlamydia trachomatis*	3,0	3,5
*Neisseria gonorrhoeae-скрин*	3,0	3,5
*Neisseria gonorrhoeae-тест*	3,0	3,5
*Neisseria gonorrhoeae* *(1-я реакция и 2-я реакция)*	3,0	3,5
*Mycoplasma genitalium*	3,0	3,8
*Treponema pallidum*	3,0	3,5
*Trichomonas vaginalis*	3,0	3,8
*HSV I, II*	3,0	3,5
*CMV*	3,0	3,5
*Ureaplasma species*	3,5	3,5
*Mycoplasma hominis*	3,5	3,5
*Candida albicans*	3,5	3,5
*Gardnerella vaginalis*	3,5	3,5
для всех вышеперечисленных тестов - порог для ВКО (по каналу HEX)	3,0

При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» (для одновременного выявления ДНК нескольких микроорганизмов) детекция флуоресцентного сигнала производится по трем или четырем каналам (в зависимости от используемого набора реагентов): по одному из каналов регистрируется сигнал о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО, по остальным каналам регистрируются сигналы о накоплении продуктов амплификации фрагментов ДНК соответствующих возбудителей.
Назначение каналов для детекции и пороговые значения, задаваемые в настройках тестов для проведения детекции при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ», представлены в табл. 3 и 4 и вкладышах к используемым наборам реагентов.

Таблица 3

Настройки тестов: пороговые значения и назначение каналов
при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Микроорганизм	Канал детекции для флуорофора	Порог отрицательного результата	Порог положительного результата
*C.trachomatis / Ureaplasma / M.genitalium* Тест «Ch.t./Ure /M.gen.»
*Chlamydia trachomatis*	FAM	3,0	3,5
*Ureaplasma spp.*	HEX	3,5	3,5
*Mycoplasma genitalium*	ROX	3,0	3,8
*C. trachomatis / Ureaplasma / M.hominis* Тест «Ch.t./Ure /M.hom.»
*Chlamydia trachomatis*	FAM	3,0	3,5
*Ureaplasma spp.*	HEX	3,5	3,5
*Mycoplasma hominis*	ROX	3,5	3,5
*N. gonorrhoeae / C. trachomatis / M.genitalium* Тест «N.gon./Ch.t./M.gen.»
*Neisseria gonorrhoeae*	FAM	3,0	3,5
*Chlamydia trachomatis*	HEX	3,0	3,5
*Mycoplasma genitalium*	ROX	3,0	3,8
*C. trachomatis / Ureaplasma* Тест «Ch.t./Ure»
*Chlamydia trachomatis*	FAM	3,0	3,5
*Ureaplasma spp.*	HEX	3,5	3,5
*C.trachomatis / M.genitalium* Тест «Ch.t./M.gen.»
*Chlamydia trachomatis*	FAM	3,0	3,5
*Mycoplasma genitalium*	HEX	3,0	3,5
**T. vaginalis / N. gonorrhoeae Тест «T.v./N.g.»**
*Trichomonas vaginalis*	FAM	3,0	3,8
*Neisseria gonorrhoeae*	HEX	3,0	3,5
HSV-typing Тест «HSV-typing»
*HSV II*	FAM	3,0	3,5
*HSV I*	HEX	3,0	3,5
*U.parvum / U.urealyticum* Тест «U.p./U.u.»
*Ureaplasma parvum*	FAM	3,5	3,5
*Ureaplasma urealyticum*	HEX	3,5	3,5
*M.hominis/ G.vaginalis* Тест «M.h./G.v.»
*Mycoplasma hominis*	FAM	3,5	3,5
*Gardnerella vaginalis*	HEX	3,5	3,5

Таблица 4

Настройки тестов: пороговые значения для ВКО
при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Тесты (наборы)	Канал для регистрации амплификации ДНК ВКО	Порог для ВКО
1-я группа – для выявления 3 микроорганизмов	Сy5	3,0
2-я группа – для выявления 2 микроорганизмов	ROX	3,0

Детально процедура проведения флуоресцентной детекции и интерпретации результатов при использовании различных детекторов описана в соответствующем подразделе в разделе «Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании различных ПЦР-детекторов».

ВНИМАНИЕ! До проведения детекции в программное обеспечение ПЦР-детектора должны быть внесены и сохранены соответствующие настройки (см. табл. 2, 3 и 4 и вкладыши к используемым наборам реагентов). Процедура внесения и проверки настроек тестов для различных ПЦР-детекторов описана в разделе «Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании различных ПЦР-детекторов».

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты интерпретируют на основании данных об уровне флуоресцентного сигнала относительно фона по соответствующим каналам для контрольных образцов и проб ДНК, полученных путем экстракции из клинических образцов. Интерпретация производится автоматически с помощью программного обеспечения используемого прибора и заданных в нем предварительно настроек теста, назначенного при проведении детекции.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма принцип интерпретации результатов следующий:

ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы сигнал по каналу FAM выше установленного порогового значения положительного результата.
ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы сигнал по каналу FAM ниже установленного порогового значения отрицательного результата, а сигнал по каналу HEX выше установленного порогового значения.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы сигнал по каналу FAM ниже установленного порогового значения отрицательного результата и сигнал по каналу HEX ниже установленного порогового значения.
Результат анализа сомнительный, если для данной пробы сигнал по каналу FAM выше установленного порогового значения отрицательного результата, но ниже порогового значения положительного результата (сигнал находится между пороговыми значениями).

Если для пробы получен невалидный или сомнительный результат, требуется повторить ПЦР-исследование соответствующего клинического образца.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с табл. 5.

Таблица 5

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Сигнал по каналу		Обозначение результата в программах некоторых детекторов
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	FAM	HEX
B-	Экстракция ДНК	Ниже порогового значения отрицательного результата	Выше порогового значения	«-» или «ОК»
К-	ПЦР	Ниже порогового значения отрицательного результата	Ниже порогового значения	«нд» или «ОК»
K+	ПЦР	Выше порогового значения положительного результата	Выше порогового значения	«+» или «ОК»

Возможные ошибки и их устранение
1. Если для положительного контроля ПЦР (К+) сигнал по каналу FAM ниже порогового значения положительного результата, необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех проб, в которых не обнаружена ДНК микроорганизма.
2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) сигнал по каналу FAM выше порогового значения положительного результата, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена ДНК данного микроорганизма, начиная с этапа экстракции ДНК.
ВНИМАНИЕ! Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) повторно получен сигнал, превышающий пороговое значение положительного результата, причиной этого может являться контаминация рабочих зон лаборатории и (или) реагентов продуктами амплификации или ДНК микроорганизмов. В таком случае необходимо провести мероприятия, направленные на выявление и устранение возможной контаминации рабочих зон лаборатории и реагентов.

При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
принцип интерпретации результатов следующий:

ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы сигнал по каналу, назначенному для регистрации результатов амплификации ДНК данного микроорганизма, выше установленного порогового значения положительного результата.
ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы сигнал по каналу, назначенному для регистрации результатов амплификации ДНК данного микроорганизма, ниже установленного порогового значения отрицательного результата, а сигнал по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК ВКО выше установленного порогового значения.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы сигнал по каналам, назначенным для регистрации результатов амплификации ДНК выявляемых микроорганизмов, ниже установленных для этих каналов пороговых значений отрицательного результата и сигнал по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК ВКО ниже установленного порогового значения.
Результат анализа сомнительный в отношении присутствия ДНК определенного микроорганизма, если для данной пробы сигнал по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК данного микроорганизма выше установленного порогового значения отрицательного результата, но ниже порогового значения положительного результата (сигнал находится между пороговыми значениями).

Если для пробы получен невалидный или сомнительный результат, требуется повторно провести амплификацию и детекцию или исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с табл. 6.

Таблица 6

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа
при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Контроль	Контролируе-мый этап ПЦР-исследования	Сигнал		Обозначение результата в программах некоторых детекторов
Контроль	Контролируе-мый этап ПЦР-исследования	по каналам для регистрации результата амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации результата амплификации ДНК ВКО	Обозначение результата в программах некоторых детекторов
B-	Экстракция ДНК	Ниже порогового значения отрицательного результата	Выше порогового значения	«-» или «ОК»
К-	ПЦР	Ниже порогового значения отрицательного результата	Ниже порогового значения	«нд» или «ОК»
K+	ПЦР	Выше порогового значения положительного результата	Выше порогового значения	«+» или «ОК»

Возможные ошибки и их устранение
1. Если для положительного контроля ПЦР (К+) сигнал по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемых микроорганизмов (FAM и/или HEX, и/или ROX) ниже порогового значения положительного результата, необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, для которых сигнал по этому каналу (каналам) ниже порогового значения положительного результата.
2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) сигнал по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемых микроорганизмов выше порогового значения положительного результата, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, для которых сигнал по этим каналам выше порогового значения положительного результата.

ВНИМАНИЕ! Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) повторно получен сигнал, превышающий пороговое значение положительного результата по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов, причиной этого может являться контаминация рабочих зон лаборатории и (или) реагентов продуктами амплификации или ДНК микроорганизмов. В таком случае необходимо провести мероприятия, направленные на выявление и устранение возможной контаминации рабочих зон лаборатории и реагентов.

ПРОВЕДЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИИ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ПЦР-ДЕТЕКТОРОВ

Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании прибора «АЛА-1/4»

Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора (автоматического люминесцентного анализатора) «АЛА-1/4» проводится согласно описанию в «Руководстве пользователя» данного прибора. Перед началом работы необходимо ввести и сохранить в программе «ALA1» настройки тестов с пороговыми значениями для используемых наборов реагентов в соответствии с таблицами 2 и 3.

Для программы ALA1 версии 5.1.0 и выше

Настройки теста можно просмотреть и при необходимости изменить, выбрав в главном меню программы закладки «Настройки», затем «Настройка тестов». После введения изменений для их сохранения следует нажать кнопку «Сохранить». Можно импортировать готовый пакет настроек тестов, воспользовавшись соответствующим файлом на специальном диске или на сайте производителя наборов реагентов. Для этого можно использовать меню «Настройки», затем «Импорт тестов».

А. Проведение флуоресцентной детекции

Включить прибор и запустить программу «ALA1» на компьютере, присоединенном к прибору.
Задать протокол детекции, выбрав в панели меню кнопку «Новый протокол» . Выбрать соответствующий тип ротора (48 х 0,2 или 36 х 0,5).

Для загрузки протокола детекции из ЛИС выбрать кнопку «Из ЛИС» (при этом должен быть выбран вариант «с поддержкой ЛИС» в подменю «Работа»).
Для создания протокола детекции выбрать нужный тест в списке тестов в меню и нажать кнопку «Добавить». Затем в графе «Количество образцов» указать количество образцов без контролей «В-», «К+» и «К-» и пробирок «Фон» и нажать кнопку «Добавить». Указать количество пробирок «Фон», выбрав нужный вариант. Ввести последовательность детектируемых образцов в колонке «Наименование образца» и указать контрольные образцы с помощью кнопок «В-», «К+» и «К-». Нажать кнопку «ОК», затем «Сохранить».

Поставить пробирки в ячейки предварительно снятого ротора прибора «АЛА-1/4» в соответствии с заданной последовательностью, установить ротор в модуль прибора, закрепив его фиксатором, и закрыть крышку. Запустить детекцию, нажав кнопку «Измерить» в панели активных кнопок (вверху экрана). По окончании детекции на экран будет выведена таблица результатов. Повторно открыть таблицу результатов можно, нажав кнопку «Результаты» в панели активных кнопок.
Если в одном протоколе проводится детекция большего, чем число ячеек в роторе, числа образцов, то после окончания детекции серии из 36 (48) образцов извлеките ротор, поместите в его ячейки следующую серию образцов, поместите ротор в прибор и для продолжения детекции нажмите кнопку «Продолжить» в окне программы.
Результаты детекции сохраняются автоматически в виде файла с названием, включающим дату и время детекции в директории ALA1/Result. Можно дополнительно сохранить файл результатов с другим именем или в другую директорию, выбрав в панели меню кнопку «Сохранить» и указав название для файла результатов (и нужную директорию). При работе с поддержкой ЛИС для передачи результатов в ЛИС нажать кнопку «Передать в ЛИС» .

Б. Интерпретация результатов

Полученные данные интерпретируются программой автоматически, результат указан в графе Результат.

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов для выявления ДНК одного микроорганизма

1.1 Для образцов, в которых обнаружена ДНК выявляемого микроорганизма, в графе результатов указано «Обнаружено».
1.2 Для образцов, в которых не обнаружена ДНК данного микроорганизма, в графе результатов указано «Не обнаружено».
1.3 Для образцов, для которых получен сигнал, который нельзя однозначно интерпретировать, указан результат «Сомнительно» (на сером фоне).
1.4 Для образцов, для которых получен невалидный результат, указан результат «Невалидный» (на светло-желтом фоне).
Если для образца получен невалидный или сомнительный результат, требуется повторно провести амплификацию и детекцию или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК (в соответствии с табл. 7).
Таблица 7
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Результат – обозначение в программе «ALA1»
В-	Экстракция ДНК	«ОК»
К-	ПЦР	«ОК»
К+	ПЦР	«ОК»

Пример полученных результатов:

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

1.1 Для образцов, в которых обнаружена ДНК одного или нескольких микроорганизмов, в графе результатов указано «Обнаружено (названия обнаруженных микроорганизмов)». Микроорганизмы, ДНК которых обнаружены в данной образце, перечислены в скобках в графе результатов. ДНК микроорганизмов, которые не указаны в графе результатов, в данном образце не обнаружены.
1.2 Для образцов, в которых не обнаружены ДНК ни одного из анализируемых микроорганизмов, в графе результатов указано «Не обнаружено».
1.3 Для образцов, для которых получен сомнительный результат в отношении ДНК определенного микроорганизма, указан результат «Сомнительно (название микроорганизма)» (на сером фоне).
1.4 Для образцов, для которых получен невалидный результат, указан результат «Невалидный» (на светло-желтом фоне).
Если для образца получен невалидный или сомнительный результат, требуется повторно провести амплификацию и детекцию или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК (в соответствии с табл. 8).

Таблица 8

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Результат – обозначение в программе «ALA1»
В-	Экстракция ДНК	«ОК»
К-	ПЦР	«ОК»
К+	ПЦР	«ОК»

Пример полученных результатов:
Результаты, полученные при использовании набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Для программы ALA1 версии до 5.1.0

Настройки теста можно просмотреть и при необходимости изменить, выбрав в главном меню программы закладки «Настройки», затем «Список тестов».
Для сохранения изменений следует нажать кнопку «Сохранить».

А. Проведение флуоресцентной детекции

Включить прибор и запустить программу «ALA1» на компьютере, присоединенном к прибору.
Задать протокол измерения, выбрав в верхнем меню «Протокол», «Создать новый». Выбрать соответствующий тип ротора (48 х 0,2 или 36 х 0,5). Выбрать нужный тест в списке тестов в меню. Ввести последовательность детектируемых образцов и фоновых образцов в колонке «Образец». Закрыть окно редактирования протокола детекции.
В качестве образца (образцов), обозначенного «ФОН», использовать образец (образцы) «Фон» (для того, чтобы обозначить образец «ФОН» в графе «Образец», используется сочетание клавиш «Ctrl» + «F»).
Поставить пробирки в ячейки предварительно снятого ротора прибора «АЛА-1/4» в соответствии с заданной последовательностью, установить ротор в модуль прибора, закрепив его фиксатором, и закрыть крышку. Запустить измерение с помощью значка детекции в панели активных кнопок (вверху экрана) или выбрав в меню пункт «Протокол», затем «Детекция».
Если в одном протоколе проводится детекция большего, чем число ячеек в роторе, числа образцов, то после окончания детекции серии из 36 (48) образцов извлечь ротор, поместить в его ячейки следующую серию образцов, поместить ротор в прибор и для продолжения детекции нажать кнопку «Продолжить» в окне программы.
По окончании детекции на экран будет выведена таблица результатов. Следует сохранить полученные результаты, выбрав в верхнем меню «Файл», затем «Сохранить как» и ввести имя файла.

Б. Интерпретация результатов

Полученные данные интерпретируются программой автоматически.

Результаты автоматической интерпретации указаны в таблице на экране (колонка «1» при использовании наборов для выявления одного микроорганизма, колонки «1», «2» и «3» при использовании наборов серии «МультиПрайм»). Знак * - сокращенное обозначение выявляемого микроорганизма.

1. Для образцов, в которых обнаружена ДНК данного микроорганизма, в соответствующей графе указано «* - обнаружено» (на лиловом фоне).
2. Для образцов, в которых не обнаружена ДНК данного микроорганизма, в соответствующей графе указано «* - не обнаружено» (на голубом фоне).
3. Для образцов, для которых получен сомнительный результат, указано «* - сомнительно».
4. Для образцов, для которых получен невалидный результат, указан знак
«* - нд» на желтом фоне.
Если для образца получен невалидный или сомнительный результат, требуется повторно провести амплификацию и детекцию или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК (в соответствии с табл. 9).

Таблица 9

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Результат
В-	Выделение ДНК	«* - не обнаружено»
К-	ПЦР	«* - нд» (отрицательный)
К+	ПЦР	«* - обнаружено»

Примеры полученных результатов:
Результаты, полученные при использовании набора для выявления одного микроорганизма.
- Результат для отрицательных контрольных образцов «B-» и «К-» - отрицательный. Результат для положительного контрольного образца «К+» - положительный. Результаты для исследуемых образцов учитывают как достоверные.
- В образцах 2, 6, 8, 10 и 13 обнаружена ДНК выявляемого микроорганизма.
- В остальных образах не обнаружена ДНК выявляемого микроорганизма.

Результаты, полученные при использовании набора серии «МультиПрайм» «АмплиСенс® C.trachomatis/ Ureaplasma-FL»

- Результат для отрицательных контрольных образцов «ОКО» и «К-» - отрицательный. Результат для положительного контрольного образца «К+» - положительный. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов учитывают как достоверные.
- В образцах 85 и 86 обнаружена ДНК Chlamydia trachomatis
- В образцах 95 и 96 обнаружены ДНК Chlamydia trachomatis и Ureaplasma spp.
- В образце 91 не обнаружены ДНК анализируемых микроорганизмов

Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании приборов «ДЖИН» или «ДЖИН-4»

Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора «Джин» проводится согласно описанию в «Паспорте детектора ПЦР флуоресцентного Джин». Перед началом работы необходимо ввести и сохранить в программе «Gene» настройки тестов (пороговые значения) для используемых комплектов реагентов в соответствии с табл. 2 или 3.
Настройки теста можно просмотреть или изменить, выбрав меню «Настройки», затем «Список тестов» в главном меню программы. Если пороговые значения не соответствуют указанным для данного теста в табл. 2 или 3 и во вкладыше к используемому набору, требуется ввести соответствующие значения и сохранить измененные настройки.
Примеры настроек теста в программе «Gene 4.4»:
Настройки теста для выявления одного микроорганизма

Пример настроек теста серии «МультиПрайм» в программе «Gene 4.4». Тест Ch.t./Ure /M.gen. для работы с набором «АмплиСенс® C.trachomatis/ Ureaplasma/ M.genitalium-FL»

А. Проведение детекции

Включить прибор и запустить программу «Gene» на компьютере, присоединенном к прибору.
Задать протокол измерения. Ввести количество детектируемых образцов (включая фоновые пробирки), выбрать нужный тест из списка в графе «Тест», нажать кнопку «OK» и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).
В качестве образца, обозначенного «ФОН», использовать контрольный образец «Фон».
Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной последовательностью (сначала первые 12 образцов) и запустить детекцию результатов ПЦР, нажав в меню соответствующую кнопку со значком .
По окончании детекции первой группы поставить следующую группу пробирок и продолжить измерения, нажав кнопку «OK». По окончании детекции вынуть пробирки и нажать кнопку «OK».
Сохранить полученные результаты в виде файла, выбрав в меню значок сохранения результатов .

Б. Интерпретация результатов

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов для выявления ДНК одного микроорганизма

Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы «Gene» - колонка Результат на экране.

Для образцов, в которых обнаружена ДНК данного микроорганизма (положительные), в графе результатов указан знак «+» на красном фоне.
Для образцов, в которых не обнаружена ДНК данного микроорганизма (отрицательные), в графе результатов указан знак «-» на зеленом фоне.
Для образцов, для которых получен сомнительный результат, в графе результатов указан знак «?» на желтом фоне (получен сигнал, который нельзя однозначно интерпретировать).
Для образцов, для которых получен невалидный результат, в графе результатов указан знак «нд» на желтом фоне.

Если для образца получен невалидный или сомнительный результат, требуется повторно провести амплификацию и детекцию или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК (в соответствии с табл. 10).

Таблица 10

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Результат
В-	Экстракция ДНК	«-» (отрицательный)
К-	ПЦР	«нд» (отрицательный)
К+	ПЦР	«+» (положительный)

Пример результатов при использовании набора
для выявления одного микроорганизма

- Результат для отрицательных контрольных образцов «B-» и «К-» - отрицательный, для образца «В-» регистрируется амплификация ДНК ВКО. Результат для положительного контрольного образца «К+» - положительный. Результаты для исследуемых образцов учитывают как достоверные.
В образцах 1 и 3 обнаружена ДНК выявляемого микроорганизма.
В образцах 2 и 5 не обнаружена ДНК выявляемого микроорганизма.
Для образца 4 получен невалидный результат, требуется повторить анализ.

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Полученные данные по каждому каналу интерпретируются автоматически с помощью программы «Gene» – колонки FAM, HEX, ROX и Cy5 на экране.
Интерпретация результатов проводится в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО, согласно инструкции, а также табл. 12 и 13.
1. В образце обнаружена ДНК определенного микроорганизма, если в графе результатов по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК данного микроорганизма указан знак «+» на красном фоне.
2. В образце не обнаружена ДНК данного микроорганизма, если в графе результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК данного микроорганизма указан знак «-» на зеленом фоне.
3. Результат анализа образца сомнительный в отношении присутствия ДНК определенного микроорганизма, если в графе сигнала об по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК данного микроорганизма указан знак «?» на желтом фоне.
4. Результат анализа образца невалидный, если указан знак «нд» на желтом фоне в графах результатов по всем каналам для регистрации результатов амплификации ДНК выявляемых микроорганизмов.
Если для образца получен невалидный или сомнительный результат, требуется повторно провести амплификацию и детекцию или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с табл. 11.

Таблица 11

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Результат по каналам для регистрации сигнала об амплификации ДНК микроорганизмов	Результат по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК ВКО
В-	Экстракция ДНК	«-» (отрицательный)	«+»
К-	ПЦР	«нд» (отрицательный)	«-»
К+	ПЦР	«+» (положительный)	«+»

Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО (для наборов группы 1)

Набор (тест) группа 1	Канал
Набор (тест) группа 1	FAM	HEX	ROX	Cy5
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium (C.t./Ure/M.g.)	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis (C.t./Ure/M.h.)	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma hominis	ВКО
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium (N.g./C.t./ M.g.)	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО

Таблица 13
Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО (для наборов группы 2)

Набор (тест) группа 2 – «дуплексы»	Канал
Набор (тест) группа 2 – «дуплексы»	FAM	HEX	ROX
U. parvum / U. Urealyticum (U.p./U.u.)	Ureaplasma parvum	Ureaplasma urealyticum	ВКО
HSV –typing (HSV –typing)	HSV II	HSV I	ВКО
T.vaginalis / N.gonorrhoeae (T.v./N.g.)	Trichomonas vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	ВКО
C.trachomatis/M.genitalium (C.t./M.g.)	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО
C.trachomatis/Ureaplasma (C.t./Ure)	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	ВКО
M.hominis /G.vaginalis (M.h./G.v.)	Mycoplasma hominis	Gardnerella vaginalis	ВКО
HSV / CMV	HSV	CMV	ВКО

Пример результатов при использовании наборов серии «МультиПрайм»:
Результаты, полученные с использованием набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контрольных образцов «B-» и «К-» - отрицательный, результат для положительного контрольного образца «К+» - положительный, что соответствует таблице правильных результатов для контролей. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 1, 4 и 7 не обнаружены ДНК ни одного из выявляемых микроорганизмов. Для них регистрируется положительный результат амплификации ДНК ВКО по каналу Cy5.
- В образце 2 обнаружены ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу FAM (здесь – Chlamydia trachomatis), и ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 3 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 5 обнаружены ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.), и ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу ROX (здесь - Mycoplasma hominis).
- Для образца 6 получен невалидный результат (не регистрируется амплификация ни ДНК ВКО, ни ДНК микроорганизмов).

Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании приборов «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q»

Для проведения флуоресцентной детекции по «конечной точке» с использованием прибора «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» и анализа результатов следует использовать русифицированную программу «Rotor-Gene» 6000 версии 1.8.17.5 (или выше).
Для анализа и интерпретации результатов используется меню АмплиСенс-FEPв меню Анализ и шаблоны, содержащие настройки тестов (пороговые значения и назначение каналов) для используемых комплектов реагентов. Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО описано в табл. 14 и 15.
А. Проведение флуоресцентной детекции

Запрограммировать прибор «Rotor-Gene» 6000 для выполнения программы детекции флуоресцентного сигнала «FEP-RG» (см. таблицу).

Программа «FEP-RG»

Цикл блок	температура	время	Кол-во циклов блока
1	35 °С	20 с	1
2	35 °С	20 с *детекция флуоресц. сигнала	3

* Детекция флуоресцентного сигнала по каналам Green, Yellow, Orange, Red.

Задать автоматическую калибровку для выбора параметра Уровень сигнала. Для этого в окне Установки каналов выбрать Опт. уровня сигн. В открывшемся окне Авто-оптимизация уровня сигнала нажать кнопку Опт. Детек-мых, пометить галочкой бокс в строке «Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Для всех каналов (Green, Yellow, OrangeиRed) нужно указать в графе Миним. Сигнал значение 2, а в графе Максим. Сигнал значение 4. В графе Позиция пробирки должен быть указан номер 1. По пробирке в этой 1-й позиции в роторе будет автоматически выбран параметр Уровень сигнала. Закрыть окно Авто-оптимизация уровня сигнала.
Рекомендуется сохранить шаблон, запрограммированный в соответствии с пп.1-2, в виде файла-шаблона FEP ИППП, который можно использовать для быстрого запуска флуоресцентной детекции по «конечной точке».
Установить в ячейки ротора пробирки одной группы, для которых выполнялся один и тот же тест (с использованием одного комплекта реагентов). В первую позицию в роторе следует поместить пробирку «Фон» для данной группы детектируемых проб.
Задать таблицу образцов, обозначив в ней пробирки «Фон» типом образца «Контроль-Фон», а все остальные образцы типом «Образец». В графе «Группа» ввести обозначение группы (краткое название теста). Задать таблицу образцов можно и после проведения детекции.
Установить ротор с фиксирующим кольцом в прибор и закрыть крышку прибора.
Запустить выполнение программы детекции флуоресцентного сигнала.
По окончании выполнения программы детекции приступить к анализу и интерпретации результатов.

Б. Анализ результатов

Перед анализом и интерпретацией результатов необходимо убедиться, что в таблице образцов для всех анализируемых образцов задана группа и обозначен тип «Контроль-Фон» для пробирок «Фон» для данной группы.
Открыть меню Анализ, выбрать вкладку Другие и в списке выбрать АмплиСенс-FEP.
Выделить одновременно все используемые для данного теста каналы: Green и Yellowдля тестов для выявления ДНК одного микроорганизма и Green, Yellow, Orange и Red (если используется) для тестов серии «МУЛЬТИПРАЙМ». Нажать кнопку Показать.
При использовании готового шаблона учета результатов импортировать установки, сохраненные в файле шаблона, нажав кнопку Импорт и выбрав в списке файловсоответствующий тесту файл шаблона учета результатов с расширением «.ena». Для всех тестов для выявления ДНК одного микроорганизма используется файл шаблона ИППП-моно.ena, для теста U.urealyticum/U.parvum– файл U.urealyticum-U.parvum.ena, для теста HSV-typing – файл HSV-typing.ena.После импорта готового файла шаблона перейти к п. 7.
В меню Пороги (под таблицей образцов) нажать кнопку Правка и установить пороги для каждого канала: для каналов GreenиYellow – порог 4.0, для канала Orange(если используется)– порог 4.0,для каналаRed(если используется) – порог 3.0.

В меню Генотипы в основном окне(над графиком) задать таблицу интерпретации результатов для каждой комбинации результатов по каждому каналу для используемого теста и нажать кнопку OK. Для всех тестов для выявления ДНК одного микроорганизма используется общая таблица интерпретации результатов, соответствующая таблице. Эта таблица дана в шаблоне ИППП-моно.ena.

Для тестов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» используются соответствующие таблицы интерпретации результатов, заданные согласно назначению каналов в табл. 14 и 15, аналогично примерам, представленным ниже. Таблицы интерпретации для каждого теста даны в соответствующих файлах-шаблонах.

В полученной таблице Результаты АмплиСенс-FEP анализа для каждого образца будет указан полученный результат в соответствующей ячейке в графе Результат.

Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО

Набор (тест) группа 1	Канал
Набор (тест) группа 1	*Green*	*Yellow*	*Orange*	*Red*
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium (C.t./Ure/M.g.)	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.hominis (C.t./Ure/M.h.)	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma hominis	ВКО
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium (N.g./C.t./ M.g.)	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО

Таблица 15

Набор (тест) группа 2 – «дуплексы»	Канал
Набор (тест) группа 2 – «дуплексы»	*Green*	*Yellow*	*Orange*
U. parvum / U. Urealyticum (U.p./U.u.)	Ureaplasma parvum	Ureaplasma urealyticum	ВКО
HSV –typing (HSV –typing)	HSV II	HSV I	ВКО
T.vaginalis / N.gonorrhoeae (T.v./N.g.)	Trichomonas vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	ВКО
C.trachomatis/M.genitalium (C.t./M.g.)	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО
C.trachomatis/Ureaplasma (C.t./Ure)	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	ВКО
M.hominis /G.vaginalis (M.h./G.v.)	Mycoplasma hominis	Gardnerella vaginalis	ВКО
HSV / CMV	HSV	CMV	ВКО

Примеры интерпретации результатов для разных тестов.
Таблица интерпретации результатов для шаблона ИППП-моно

Таблица интерпретации результатов для шаблона теста HSV-typing

Таблица интерпретации результатов для шаблона теста C.trachomatis / Ureaplasma /M.genitalium

Генотип	Каналы детекции	Каналы детекции	Каналы детекции	Каналы детекции
Не обнаружено			Cycling A.Red
НД
Chl.trachomatis	Cycling A.Green		Cycling A.Red
Chl.trachomatis	Cycling A.Green
Ureapalsma spp.			Cycling A.Red	Cycling A.Yellow
Ureapalsma spp.				Cycling A.Yellow
Myc.genitalium		Cycling A.Orange	Cycling A.Red
Myc.genitalium		Cycling A.Orange
Chl.trachomatis, Myc.genitalium, Ureapalsma spp.	Cycling A.Green	Cycling A.Orange	Cycling A.Red	Cycling A.Yellow
Chl.trachomatis, Myc.genitalium, Ureapalsma spp	Cycling A.Green	Cycling A.Orange		Cycling A.Yellow
Chl.trachomatis, Ureapalsma spp.	Cycling A.Green		Cycling A.Red	Cycling A.Yellow
Chl.trachomatis, Ureapalsma spp.	Cycling A.Green			Cycling A.Yellow
Chl.trachomatis, Myc.genitalium	Cycling A.Green	Cycling A.Orange	Cycling A.Red
Chl.trachomatis, Myc.genitalium	Cycling A.Green	Cycling A.Orange
Myc.genitalium, Ureapalsma spp.		Cycling A.Orange	Cycling A.Red	Cycling A.Yellow
Myc.genitalium, Ureapalsma spp.		Cycling A.Orange		Cycling A.Yellow

В. Интерпретация результатов

Полученные данные интерпретируются программой автоматически c использованием настроек теста в выбранном для анализа шаблоне, результат указан в графе Результат.

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов для выявления ДНК одного микроорганизма

1.1 Для образцов, в которых обнаружена ДНК выявляемого микроорганизма, в графе результатов указано «Обнаружено».
1.2 Для образцов, в которых не обнаружена ДНК данного микроорганизма, в графе результатов указано «Не обнаружено».
1.3 Для образцов, для которых получен невалидный результат, указано обозначение «НД».
Если для образца получен невалидный результат, требуется повторно провести амплификацию и детекцию или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК в соответствии с табл. 16.

Таблица 16

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Результат в программе «Rotor-Gene»	Результат по каналу Green	Результат по каналу Yellow
В-	Экстракция ДНК	Не обнаружено	Нет реакции	Реакция
К-	ПЦР	НД	Нет реакции	Нет реакции
К+	ПЦР	ОБНАРУЖЕНО	Реакция	Реакция

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

1.1 Для образцов, в которых обнаружены ДНК одного или нескольких анализируемых микроорганизмов, в графе Результат перечислены обнаруженные микроорганизмы (сокращенные обозначения).
Примечание. Рекомендуется расширить границы столбца Результат, чтобы видеть все обозначенные в нем результаты.
1.2 Для образцов, в которых не обнаружена ДНК ни одного из анализируемых микроорганизмов, в графе результатов указано «Не обнаружено».
1.3 Для образцов, для которых получен невалидный результат, указано обозначение «НД».
Если для образца получен невалидный результат, требуется повторно провести амплификацию и детекцию или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК в соответствии с табл. 17.

Таблица 17

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Результат по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации ДНК микроорганизмов
В-	Экстракция ДНК	Нет реакции
К-	ПЦР	Нет реакции
К+	ПЦР	Реакция

Примеры полученных результатов:
Результаты, полученные при использовании набора «АмплиСенс® HSV-typing-FL»

Результаты, полученные при использовании набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Состав

Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT включает:

*Реагент*	*Описание*	*Объем, мл*	*Кол-во*
ПЦР-смесь-1-FL	Раствор, содержащий праймеры, дНТФ и олигонуклеотидные зонды	0,01	110 пробирок объемом 0,2 мл
ПЦР-смесь-2-FL-red	Буферный раствор, содержащий Taq-полимеразу, Mg2+	1,1	1 пробирка
ПКО комплексный	Раствор, содержащий специфические фрагменты ДНК анализируемых микроорганизмов (в составе генно-инженерных конструкций)	0,2	1 пробирка
ДНК-буфер	Буферный раствор	0,5	1 пробирка

Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли.
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F включает:

*Реагент*	*Описание*	*Объем, мл*	*Кол-во*
ПЦР-смесь-1-FL	Раствор, содержащий праймеры, дНТФ и олигонуклеотидные зонды	1,2	1 пробирка
ПЦР-смесь-2-FRT	Буферный раствор, содержащий Mg2+	0,3	2 пробирки
Полимераза (TaqF)	Раствор, содержащий Taq-полимеразу модифицированную	0,03	2 пробирки
ПКО комплексный	Раствор, содержащий специфические фрагменты ДНК анализируемых микроорганизмов (в составе генно-инженерных конструкций)	0,2	1 пробирка
ДНК-буфер	Буферный раствор	0,5	1 пробирка

Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли.

Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-1000 F включает:

*Реагент*	*Описание*	*Объем, мл (мл)*	*Кол-во*
ПЦР-смесь-1-FL	Раствор, содержащий праймеры, дНТФ и олигонуклеотидные зонды	1,2	10 пробирок
ПЦР-смесь-2-FRT	Буферный раствор, содержащий Mg2+	1,2	5 пробирок
Полимераза (TaqF)	Раствор, содержащий Taq-полимеразу модифицированную	0,12	5 пробирок
ПКО комплексный	Раствор, содержащий специфические фрагменты ДНК анализируемых микроорганизмов (в составе генно-инженерных конструкций)	1,0	1 пробирка
ДНК-буфер	Буферный раствор	0,5	2 пробирки

Комплект реагентов рассчитан на проведение 1100 реакций амплификации, включая контроли.

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ C ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»

А. Подготовка пробирок для проведения амплификации
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени».
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.
А1. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT
Общий объем реакционной смеси – 30 мкл, включая объем пробы ДНК – 10 мкл.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FL для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.
На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2-FL-red, при этом она
не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FL.
В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых или контрольных образцов.
Поставить контрольные реакции:

а) отрицательный контроль ПЦР (К-) – внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.
б) положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО комплексного.
в) отрицательный контроль экстракции ДНК (B-) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ОКО.
А2. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F и FRT-1000 F
Общий объем реакционной смеси – 25 мкл, включая объем пробы ДНК – 10 мкл.

Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-2-FRT. Перемешать содержимое пробирок, содержащих ПЦР-смесь-1-FL, ПЦР-смесь-2-FRT и полимеразой (TaqF), и осадить капли кратковременным центрифугированием (1-2 с) с помощью центрифуги/вортекса.
Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.
Для проведения N реакций (включая 2 контроля ПЦР) смешать в отдельной пробирке 10*(N+1) мкл ПЦР-смеси-1-FL, 5,0*(N+1) мкл ПЦР-смеси-2-FRT и 0,5*(N+1) мкл полимеразы (TaqF).
Перемешать подготовленную смесь и осадить капли кратковременным центрифугированием с помощью центрифуги/вортекса.
Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной смеси.
В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых или контрольных образцов.
Поставить контрольные реакции:

а) отрицательный контроль ПЦР (К-) – внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.
б) положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО комплексного.
в) отрицательный контроль экстракции ДНК (B-) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ОКО.

Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»

Запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени») для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала «АмплиСенс-1» (см. табл. 18).

Таблица 18

Программа «АмплиСенс-1»

	Приборы роторного типа¹			Приборы планшетного типа²
Цикл	Температура, °С	Время	Кол-во циклов	Температура, °С	Время	Кол-во циклов
1	95	15 мин	1	95	15 мин	1
2	95	5 с	5	95	5 с	5
	60	20 с		60	20 с
	72	15 с		72	15 с
3	95	5 с	40	95	5 с	40
	60	20 с детекция флуоресц. сигнала		60	30 с детекция флуоресц. сигнала
	72	15 с		72	15 с

Детальная информация о программировании различных приборов для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» представлена в разделе «Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов».

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора.
Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала.
По окончании выполнения программы приступить к анализу результатов.

¹ например, «Rotor-Gene» 3000, «Rotor-Gene» 6000, «Rotor-Gene Q» или аналогичные.
² например, «iCycler», «iQ5», «Mx3000P», «Mx3000», «ДТ-96» или аналогичные.

АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР c детекцией в режиме «реального времени». Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по каналам для регистрации накопления продуктов амплификации фрагментов ДНК каждого из выявляемых микроорганизмов и по каналу для регистрации продукта амплификации ДНК ВКО.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или, соответственно, отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.
Для анализа результатов по каждому каналу необходимо установить на соответствующем уровне пороговую линию и включить необходимые опции обработки данных в соответствии с описанием для используемого прибора и набора реагентов в разделе «Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов».

При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
- по каналу для флуорофора JOE регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

Принцип интерпретации результатов следующий:

ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM определено значение порогового циклаCt. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
ДНК микроорганизма необнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для флуорофора JOE определено значение порогового цикла Ct, не превышающее указанное (граничное) значение.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу для флуорофора FAM, и по каналу для флуорофора JOE значение Ctтакже не определено (отсутствует) илипревышает указанное граничное значение. В этом случае требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего клинического образца.

ВНИМАНИЕ! Граничные значения Ct указаны во вкладыше к ПЦР-комплекту и в разделе «Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов» данных методических рекомендаций.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (табл. 19).
Таблица 19
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Ct
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналу для флуорофора FAM	по каналу для флуорофора JOE
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение меньше граничного
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение меньше граничного

Возможные ошибки и их устранение
1. Если для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла по каналу для флуорофора FAM отсутствует или превышает граничное значение, необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК микроорганизма.
2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) зафиксировано значение порогового цикла по каналу для флуорофора FAM, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена ДНК микроорганизма, начиная с этапа экстракции ДНК.
ВНИМАНИЕ! Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) повторно зафиксировано значение порогового цикла по каналу для флуорофора FAM, причиной этого может являться контаминация рабочих зон лаборатории и (или) реагентов продуктами амплификации или ДНК микроорганизмов. В таком случае необходимо провести мероприятия, направленные на выявление и устранение возможной контаминации рабочих зон лаборатории и реагентов.
3. Если для пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM зафиксировано значение порогового цикла, но график флуоресценции по этому каналу не имеет правильной формы с участком характерного экспоненциального подъема флуоресценции (в частности, если график представляет собой прямую линию), этот результат является ошибочным, его нельзя интерпретировать как положительный результат. Такой результат может свидетельствовать о неправильно установленном уровне пороговой линии (или других параметров анализа). Если же он получен при правильном уровне порога (и других параметрах), то необходимо повторить для данной пробы (проб) амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» для получения правильного результата.
При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК ВКО. Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО указано в табл. 20 и в инструкции к используемому набору реагентов.
Наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» можно разделить на две группы: наборы для одновременного выявления трех или четырех различных микроорганизмов – группа 1, и наборы для одновременного выявления двух микроорганизмов («дуплексы») – группа 2.
Сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО, при работе с наборами первой группы регистрируется по каналу для флуорофора Cy5, а при работе с наборами второй группы («дуплексами») – по каналу для флуорофора ROX.

Таблица 20

Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО

Набор (тест), группа 1	Канал для флуорофора
Набор (тест), группа 1	FAM	JOE	ROX	Cy5	Cy5.5 (Crimson) *
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium/ T.vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО	Trichomonas vaginalis
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium/ M.hominis	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО	Mycoplasma hominis
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО	-
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma hominis	ВКО	-
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ T. vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Trichomonas vaginalis	ВКО	-
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО	-
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	Candida albicans	Candida glabrata	Candida krusei	ВКО	-
Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»
U. parvum / U. Urealyticum	Ureaplasma parvum	Ureaplasma urealyticum	ВКО	-	-
HSV-typing	HSV II	HSV I	ВКО	-	-
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	Trichomonas vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	ВКО	-	-
HSV / CMV	HSV	CMV	ВКО	-	-

*) Канал для флуорофора Сy5.5 (канал Crimson) имеется у приборов «Rotor-Gene 6000» и «Rotor-Gene Q».
Принцип интерпретации результатов следующий:

ДНК микроорганизмаобнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК данного микроорганизма (в соответствии с инструкцией к используемому набору) определено значение порогового циклаCt. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
ДНК микроорганизма необнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по соответствующему каналу не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию).
ДНК ни одного из анализируемых микроорганизмов необнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каждому из каналов для регистрации сигнала об амплификации ДНК анализируемых микроорганизмов не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct(кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК ВКО определено значение порогового цикла Ct, не превышающее указанное (граничное) значение.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК микроорганизмов и по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК ВКО значение Сtтакже не определено (отсутствует) илипревышает указанное граничное значение. В этом случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

Граничные значения Ct указаны во вкладыше к ПЦР-комплекту и в разделе «Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов» данных методических рекомендаций.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции (выделения) ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (табл. 21).

Таблица 21

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Ct
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналам для регистрации сигнала об амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации сигнала об амплификации ДНК ВКО
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение меньше граничного
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение меньше граничного

Возможные ошибки и их устранение
1. Если для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла отсутствует или превышает граничное по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов, необходимо повторить амплификацию для всех проб, для которых отсутствует значение порогового цикла по этим каналам.
2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) зафиксировано значение порогового цикла по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, для которых зафиксировано значение порогового цикла по этому каналу (каналам), начиная с этапа экстракции ДНК.
ВНИМАНИЕ! Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) повторно зафиксировано значение порогового цикла по одному или нескольким каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов, причиной этого может являться контаминация рабочих зон лаборатории и (или) реагентов продуктами амплификации или ДНК микроорганизмов. В таком случае необходимо провести мероприятия, направленные на выявление и устранение возможной контаминации рабочих зон лаборатории и реагентов.

3. Если для пробы в таблице результатов по определенному каналу зафиксировано значение порогового цикла, но график флуоресценции по этому каналу не имеет правильной формы с участком характерного экспоненциального подъема флуоресценции (в частности, если график представляет прямую линию), этот результат является ошибочным, его нельзя интерпретировать как положительный результат. Такой результат может свидетельствовать о неправильно установленном уровне пороговой линии (или других параметров анализа). Если же такой результат получен при правильном уровне порога (и других параметрах), то необходимо повторить для данной пробы амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» для получения достоверного результата.

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ПРИБОРОВ

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «Rotor-Gene» 3000 или 6000 или «Rotor-Gene Q»

Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу «Rotor-Gene» 6 версии 6.1 или выше, с прибором «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» - русифицированную программу «Rotor-Gene» 6000 версии 1.8.17.5 (или выше) или программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build 67) или выше.

А1. Создание шаблона для программы с русскоязычным интерфейсом

Для создания шаблона следует выбрать в окне Новый тест режим Детальный мастер. Выбрать любой шаблон (например, Двухшаговый цикл) для редактирования и нажать кнопку Новый.
В следующем окне выбрать тип ротора: 36-луночный ротор. Установить галочку в строке Кольцо закреплено.
В окне, следующем после окна выбора ротора, необходимо установить объем реакционной смеси равный 25 в строке Объем реакции. Установить галочку в боксе в строке 15 ?L с добав. воска, чтобы активировать эту опцию.
В окне Редактор профиля следует задать программу «АмплиСенс-1»:

Удерж. темп-ры 95 °С - 15 мин
Циклирование
95 °С - 5 с
60 °С - 20 с
72 °С - 15 с

Цикл повторить – 5 раз.

Циклирование 2
95 °С - 5 с
60 °С - 20 с – Детекция *
72 °С - 15 с

Цикл повторить – 40 раз.

* Детекция флуоресцентного сигнала назначается на втором шаге (60 °С) второго блока циклирования (Детек. на CyclingA / AcquiringtoCyclingA) по каналам Green, Yellow, Orange,Red, Crimson.
ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения тестов с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» для выявления ДНК возбудителей ИППП и др. инфекций органов репродукции. Поэтому можно одновременно в одном приборе проводить все эти тесты или любое их сочетание, включая все тесты для выявления и генотипирования вирусов папилломы человека (ВПЧ ВКР).
При работе только с «ПЦР-комплектами» вариант FRT, в которых используется прослойка воска, можно вместо программы «АмплиСенс-1» использовать альтернативную программу «60-45 RG» (что позволяет сократить на 10 мин время выполнения амплификации и детекции прибором). Для этого надо создать отдельный шаблон «60-45», в котором в окне Редактор профиля задать альтернативную программу «60-45 RG»:

Удерж. темп-ры 95 °С - 5 мин
Циклирование
95 °С - 5 с
60 °С - 20 с
72 °С -15 с

Цикл повторить – 5 раз.

Циклирование 2
95 °С - 5 с
60 °С - 20 с – Детекция *
72 °С -15 с

Цикл повторить – 40 раз

Детекция флуоресцентного сигнала назначается также как для программы «АмплиСенс-1».
Задав программу амплификации и детекции, нажать кнопку OK.
5. Задать автоматическую калибровку для выбора параметра Уровень сигнала. Для этого в окне Установки каналов нажать кнопку Опт.уровня сигн. В открывшемся окне Авто-оптимизация уровня сигнала нажать кнопку Опт. Детек-мых. В строке Нужный диапазон стартового сигнала для канала Green нужно указать минимальный сигнал - 5, а максимальный сигнал - 10.
Для каналов Yellow, Orange, RedиCrimson нужно указать минимальный сигнал - 4, а максимальный сигнал - 8. В графе Позиция пробирки должен быть указан номер пробирки - 1, по сигналу которой будет автоматически выбран параметр Уровень сигнала. Пометить галочкой бокс в строке Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции. Закрыть окно Авто-оптимизация уровня сигнала.
6. Перейти в следующее окно. Сохранить запрограммированный шаблон выполнения теста. Для этого нажать кнопку Сохр.шаблон. Задать имя для файла шаблона, соответствующее заданной в нем программе амплификации - «АмплиСенс-1» или «60-45 RG». Сохранить файл в предлагаемую папку: Templates\QuickStartTemplates; закрыть окно Мастер Нового Теста. После этого запрограммированный шаблон теста появится в списке шаблонов в окне Новый тест.
Запрограммированный согласно данному описанию шаблон теста можно использовать для запуска любых тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП и др. инфекций органов репродукции с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT, FRT-100F и FRT-1000F (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).
Примечание. Чтобы редактировать таблицу образцов до старта выполнения программы теста, необходимо выбрать в меню Файл подменю Предпочтения и в открывшемся окне (вкладка Установки пользователя пункт Опции редактирования образцов) выбрать пункт Редактировать образцы перед стартом теста.

А2. Создание шаблона для программы с англоязычным интерфейсом.
Далее по тексту термины, соответствующие разным моделям приборов, указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для прибора «Rotor-Gene» 6000 (или «Rotor-Gene Q»). Если термины совпадают для разных моделей прибора, то указан один термин.

Для программирования и создания шаблона следует выбрать в окне NewRunрежим программирования Advanced. Выбрать любой шаблон (например, Hydrolysisprobes / DualLabeledProbe) для редактирования и нажать кнопку New. В следующем окне выбрать тип ротора 36-WellRotor. Установить галочку в строке No Domed Tubes / Locking Ring Attached.
В окне, следующем после окна выбора ротора, необходимо установить объем реакционной смеси ReactionVolume(?L).
Для прибора «Rotor-Gene» 3000 вводится значение 30.
Для прибора «Rotor-Gene» 6000 вводится значение 25, после чего необходимо установить галочку в боксе в строке 15 ?Loillayervolume, чтобы активировать эту опцию.

В окне Edit Profile следует задать программу «АмплиСенс-1»:

Hold 95 °С - 15 min
Cycling
95 °С - 5 sec
60 °С - 20 sec
72 °С -15 sec

Cycle repeats – 5 times

Cycling 2
95 °С - 5 sec
60 °С - 20 sec – Acquiring *
72 °С - 15 sec

Cycle repeats – 40 times

* Acquiring - детекция флуоресценции назначается на втором шаге (60 °С) второго блока циклирования (Acquiring to Cycling A) по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red, Crimson.
Задав программу амплификации и детекции, нажать кнопку OK.
ВНИМАНИЕ! Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения тестов с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» для выявления ДНК возбудителей ИППП. Поэтому можно одновременно в одном приборе проводить все тесты или любое их сочетание, включая тесты для выявления и генотипирования вирусов папилломы человека (ВПЧ ВКР).
При работе только с «ПЦР-комплектами» вариант FRT, в которых используется прослойка воска можно вместо программы «АмплиСенс-1» использовать альтернативную программу «60-45 RG» (что позволяет сократить на 10 мин время выполнения амплификации и детекции прибором). Для этого надо создать отдельный шаблон «60-45», в котором в окне Редактор профиля задать альтернативную программу «60-45 RG»:

Hold 95 °С – 5 min
Cycling
95 °С - 5 sec
60 °С - 20 sec
72 °С -15 sec

Cycle repeats – 5 times

Cycling 2
95 °С - 5 sec
60 °С - 20 sec – Acquiring *
72 °С - 15 sec

Cycle repeats – 40 times

* Детекция флуоресцентного сигнала назначается так же, как для программы «АмплиСенс-1».
4. Задать автоматическую калибровку для выбора параметра «gain». Для этого в окне Channel Setup нажать кнопку Calibrate/Gain Optimisation. В открывшемся окне Auto Gain Calibration Setup нажать кнопку Calibrate Acquiring/Optimize Acquiring. Для канала FAM/Greenнужно указать в графе MinReadingзначение 5, а в графе MaxReadingзначение 10. Для каналов JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/RedиCrimsonнужно указать в графе MinReadingзначение 4, а в графе MaxReading–значение 8. В графе Tubeposition должен быть указан номер пробирки – 1, по сигналу которой будет автоматически выбран параметр «gain». Пометить галочкой бокс в строке Perform Calibration Before 1-st Acquisition/Perform Optimisation Before 1-st Acquisition. Закрыть окно AutoGainCalibrationSetup.
5. Перейти в следующее окно. Сохранить запрограммированный шаблон выполнения теста, нажав кнопку SaveTemplate. Задать имя для файла шаблона, соответствующее заданной в нем программе амплификации, – «АмплиСенс-1» или «60-45 RG». Сохранить файл в предлагаемую папку: Templates(и в ней в папку QuickStartTemplates) и закрыть окно NewRunWizard. После этого запрограммированный шаблон теста появится в списке шаблонов в окне NewRun.
Запрограммированный таким образом шаблон «АмплиСенс-1» можно использовать для проведения амплификации и детекции при проведении любых тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью комплектов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Б. Проведение амплификации и детекции с использованием готового шаблона

Б1. Для «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» с русскоязычным интерфейсом программы

Установить пробирки в ротор. При этом в первой позиции должна быть установлена одна из подготовленных для анализа пробирок с реакционной смесью (см. Примечание 1 и 2). Установить фиксирующее кольцо, прикрепить ротор, совместив отверстие для фиксатора с фиксатором, закрыть крышку прибора.
Для запуска с использованием готового шаблона выбрать в меню Новый, вверху окна Новый тест выбрать вкладку Детальный мастер, затем в списке шаблонов в этом окне выбрать нужный шаблон с программой амплификации и детекции «АмплиСенс-1» (запрограммированный согласно описанию в разделе «Создание шаблона»). При работе только с «ПЦР-комплектами» вариант FRT, в которых используется прослойка воска, можно использовать шаблон с другой программой амплификации и детекции - «60-45 RG».
В окне выбора ротора выбрать тип ротора: 36-луночный ротор или 72-луночный ротор.Поставить галочку в боксе Кольцо закреплено. Перейти в следующее окно, нажав кнопку Далее.
В следующем окне нужно проверить, что указан объем реакционной смеси Объем реакции равный 25 и в боксе 15 ?L с добав. воскаустановлена галочка, активирующая эту опцию.
В окне таблицы образцов задать последовательность расположения образцов в роторе, указав для каждого образца его имя (идентификатор) и для всех образцов тип Образец.Нажать кнопку OK. Отредактировать таблицу образцов можно также после старта выполнения программы амплификации.

Примечание. Для редактирования таблицы образцов до старта нужно, чтобы предварительно в меню Файл подменю Предпочтения был выбран пункт Редактировать образцы перед стартом теста.
См. также Примечание 3.

В следующем окне можно проверить правильность программ амплификации и детекции и условий авто-оптимизации уровня сигнала, заданных в шаблоне, в соответствии с пунктом 1. Перейти в следующее окно, нажав кнопку Далее. Примечание. Если не используются наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ», то в окне Редактор профиля каналы Orange, Red и Crimson можно выключить, оставив назначенной детекцию по каналам Green и Yellow.
В последнемперед стартомокнезапустить выполнение программы прибором с помощью кнопки Стартв нижней части окна. При этом ротор должен быть уже прикреплен и крышка прибора закрыта. Задать имя файла, в котором будут сохранены результаты, и нажать кнопку Сохранить.
После окончания выполнения программы амплификации приступить к учету результатов.

ВНИМАНИЕ! После окончания выполнения программы амплификации пробирки удаляют из ротора и утилизируют.
Примечание 1. Первая пробирка в роторе используется для автоматической оптимизации уровня сигнала, поэтому в 1-ой позиции в роторе должна находиться пробирка с реакционной смесью. При одновременном проведении различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью наборов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора в качестве 1-ой пробирки можно использовать пробирку с любой из подготовленных реакционных смесей. При одновременном проведении тестов с использованием наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» в 1-ую позицию в роторе необходимо помещать пробирку с реакционной смесью набора реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ», для которого используется максимальное число каналов.
Примечание 2. Нельзя использовать для заполнения ротора пробирки с ПЦР-смесью, ранее уже прошедшие амплификацию. Ячейки ротора допустимо оставлять незаполненными.
Примечание 3. При одновременном проведении тестов для выявления ДНК ВПЧ и различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью наборов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора следует в таблице образцов создать вторую страницу и в ней задать образцы, для которых проводится тест на наличие ДНК ВПЧ (тип «образец»), а для остальных образцов назначить тип «пустой». Это имеет значение для последующего анализа результатов.

Б2. Для «Rotor-Gene» 3000, «Rotor-Gene» 6000 и «Rotor-Gene Q» с англоязычным интерфейсом программы
Далее по тексту термины, соответствующие разным моделям приборов, указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для прибора «Rotor-Gene» 6000 (если термины совпадают для разных моделей прибора, то указан один термин).

Установить пробирки в ротор. При этом в первой позиции должна быть установлена одна из подготовленных для анализа пробирок с реакционной смесью (см. Примечание 1 и 2). Установить фиксирующее кольцо, прикрепить ротор, совместив отверстие для фиксатора с фиксатором, закрыть крышку прибора.
Для запуска с использованием готового шаблона выбрать в меню New Run, вверху окна New Run Wizardвыбрать вкладку Advanced. В списке шаблонов в этом окне выбрать нужный шаблон с программой амплификации и детекции «АмплиСенс-1» (запрограммированный согласно описанию в разделе «Создание шаблона»).

При работе только с «ПЦР-комплектами» вариант FRT, в которых используется прослойка воска, можно использовать шаблон с другой программой амплификации и детекции - «60-45 RG».

В окне выбора ротора выбрать тип используемого ротора: 36-WellRotorили 72-WellRotor(соответственно, 36-луночный или 72-луночный).Установить галочку в строке No Domed Tubes / Locking Ring Attached. Перейти в следующее окно.
В следующем окне можно проверить правильность указания объема реакционной смеси, а при работе с «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» проверить, что в боксе 15 ?Loillayervolumeустановлена галочка, активирующая эту опцию. Перейти в следующее окно.
В следующем окне можно проверить правильность программы амплификации и детекции и условий авто-оптимизации уровня сигнала, заданных в шаблоне (в соответствии с описанием в разделе «Создание шаблона»).

Примечание. Если не используются наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ», то в окне EditProfileдетекцию поканалам ROX/Orange, Cy5/Red и Crimson можно выключить, оставив назначенной детекцию по каналам FAM/Green и JOE/Yellow.

В последнемперед стартомокнезапустить программу с помощью кнопки Startв нижней части окна. При этом ротор должен быть уже прикреплен и крышка прибора закрыта. Задать имя файла, в котором будут сохранены результаты, и нажать кнопку Save.
В окне таблицы образцов задать последовательность расположения образцов в роторе, указав для каждого образца его имя (идентификатор) и тип Unknown.Нажать кнопку Finish/OK.

Примечание. При работе с «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» можно редактировать таблицу образцов до старта. Для этого нужно предварительно в меню File, подменю Userpreferencesвыбрать пункт EditSamplesBeforeRunStarted.
См. также Примечание 3.

После окончания выполнения программы амплификации приступить к учету результатов.

ВНИМАНИЕ! После окончания выполнения программы амплификации пробирки удаляют из ротора и утилизируют.
Примечание 1. Первая пробирка в роторе используется для автоматической оптимизации уровня сигнала, поэтому в 1-ой позиции в роторе должна быть помещена пробирка с реакционной смесью. При одновременном проведении в приборе нескольких различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в качестве 1-ой пробирки можно использовать пробирку с любой из подготовленных реакционных смесей, помещенную в 1-ю позицию в роторе. При одновременном проведении тестов с использованием наборов серии «МультиПрайм» в 1-ую позицию в роторе необходимо помещать пробирку с реакционной смесью реагентов набора серии «МультиПрайм», для которого используется максимальное число каналов.
Примечание 2. Нельзя использовать для заполнения ротора пробирки с ПЦР-смесью, ранее уже прошедшие амплификацию. Ячейки ротора допустимо оставлять незаполненными.
Примечание 3. При одновременном проведении тестов для выявления ДНК ВПЧ и различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью наборов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора следует в таблице образцов создать вторую страницу и в ней задать образцы, для которых проводится тест для выявления ДНК ВПЧ, а для остальных образцов назначить тип «none». Это имеет значение при последующем анализе результатов.

В. Анализ результатов, полученных при использовании приборов «Rotor-Gene» 3000 или 6000 и «Rotor-Gene Q»

В1. Анализ результатов при использовании программы с русскоязычным интерфейсом
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют графики накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам: по каналу Green регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма, по каналу Yellow регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

Выбрать в главном меню значок меню Анализ, в ниспадающем меню выбрать вкладку Количественный. Выполнить операцию для данных канала Green, выбрав в поле «CyclingAGreen», затем для данных канала Yellow, выбрав в поле «CyclingAYellow».
Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, регистрируемых по каналу Yellow.

Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Yellow. В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич.фон (включена по умолчанию). Включить кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии - в меню Вычисление Ct ввести в текстовом поле Порог значение 0,1. В таблице результатов по каналу Yellow будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Количественные результаты – CyclingA. Yellow» под окном графиков).

Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК микроорганизма, регистрируемых по каналу Green.

Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Green. В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич. фон (включена по умолчанию). Кнопка Коррект. уклонадолжна быть выключена или включена в соответствии c указанным вариантом в табл. 22 для используемого набора реагентов. Нажать кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение, указанное в табл. 22 для используемого набора. Задать уровень пороговой линии: в меню Вычисление Ct ввести в текстовом поле Порог значение 0,1.В таблице результатов по каналу Green будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Количественные результаты – Cycling A. Green» под окном графиков).

Таблица 22

Параметры анализа результатов по каналу Green

Наименование набора	Порог	Устранение выбросов	Коррект. уклона
Chlamydia trachomatis	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae-скрин	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae-тест	0,1	0	выключена
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)	0,1	0	выключена
Mycoplasma genitalium	0,1	0	выключена
Ureaplasma species	0,1	0	выключена
Mycoplasma hominis	0,1	0	выключена
HSVI, II	0,1	0	выключена
CMV	0,1	0	выключена
Gardnerella vaginalis	0,1	0	выключена
Treponema pallidum	0,1	5	включена
Trichomonas vaginalis	0,1	5	включена
Candida albicans	0,1	0	выключена

Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green определено значение порогового цикла Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green не определено (отсутствует) значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу Yellow определено значение Ct, не превышающее граничного значения 30.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green не определено значение порогового цикла Ct и в таблице результатов по каналу Yellow значение Ctтакже отсутствует или превышает 30. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 23 и 24).
Таблица 23
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа
при использовании наборов для выявления одного микроорганизма

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Ct
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналу Green	по каналу Yellow
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение <30
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение <30

Таблица 24

Граничные значения порогового цикла по каналу Green для положительного контроля

Наименование ПЦР-комплекта-FRT	Граничное значение Сt по каналу Green для «К+»
Chlamydia trachomatis	30
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	33
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

Пример полученных результатов:

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу Yellow (канал для ВКО) менее 30. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по обоим каналам не превышают граничных значений. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 2, 5 и 6 обнаружена ДНК выявляемого микроорганизма (определены значения Ct по каналу Green).
- В образцах 1, 3 и 4 не обнаружена ДНК микроорганизма. По каналу для ВКО - каналу Yellow - определены значения Ct менее 30.
При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагмента ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в табл. 25 и 26 и в инструкции (каналы Green, Yellow, Orange, Crimson). Результаты амплификации ДНК ВКО регистрируются при использовании наборов первой группы (для одновременного выявления трех или четырех различных микроорганизмов) – по каналу Red, а при использовании наборов второй группы (для одновременного выявления двух микроорганизмов) – по каналу Orange.
Результаты интерпретируются на основании данных, полученных по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО, согласно табл. 25 и 26.
Таблица 25
Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации
фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО
(для наборов группы 1)

Набор (тест), группа 1	Канал
Набор (тест), группа 1	Green	Yellow	Orange	Red	Crimson
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium/ T.vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО	Trichomonas vaginalis
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium/ M.hominis	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО	Mycoplasma hominis
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma genitalium	ВКО	-
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	Chlamydia trachomatis	Ureaplasma spp.	Mycoplasma hominis	ВКО	-
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Mycoplasma genitalium	ВКО	-
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	Candida albicans	Candida glabrata	Candida krusei	ВКО	-

Назначение каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО
(для наборов группы 2)

Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»	Канал
Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»	Green	Yellow	Orange
U. parvum / U. urealyticum	Ureaplasma parvum	Ureaplasma urealyticum	ВКО
HSV-typing	HSV II	HSV I	ВКО
T. vaginalis /N.gonorrhoeae	Trichomonas vaginalis	Neisseria gonorrhoeae	ВКО
HSV / CMV	HSV	CMV	ВКО

Чтобы проанализировать данные по определенному каналу, нужно выбрать в главном меню значок Анализ, в ниспадающем меню выбрать вкладку Количественный и нужный канал (например, канал Green - «CyclingAGreen», канал Yellow - «CyclingAYellow» и т.д.).

Анализ результатов амплификации ДНК ВКО.
Для первой группы тестов: выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Red. В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич.фон (включена по умолчанию). Включить кнопку Коррект.уклона, затем включить кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии - в меню Вычисление Ct ввести в текстовом поле Порог значение 0,07. В таблице результатов по каналу Red будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Количественные результаты – CyclingA. Red» под окном графиков).
Для второй группы тестов («дуплексов»): выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Orange. В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич.фон (включена по умолчанию). Включить в меню над графиками кнопку Коррект.уклона, затем включить кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии - в меню Вычисление Ct ввести в текстовом поле Порог значение 0,07. В таблице результатов по каналу Orange будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Количественные результаты – CyclingA. Orange» под окном графиков).

Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу со значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.
1.2 Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов.
Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:

Выбрать в главном меню значок меню Анализ, в ниспадающем меню выбрать вкладку Количественный и нужный канал.
Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по данному каналу.
В меню над графиками должна быть включена кнопка Динамич. фон (включена по умолчанию), кнопка Коррект. уклонадолжна быть выключена или включена в соответствии с табл. 27 для данного канала (включена – для канала Crimson, выключена – для всех остальных). Включить кнопку Устранение выбросов и ввести в текстовом поле значение, указанное в табл. 27 для данного канала.
Задать уровень пороговой линии: в меню Вычисление Ctввести в текстовом поле Порог значение 0,1.
В таблице результатов по данному каналу будут указаны значения пороговых циклов Ct для каждой пробы (окно Количественные Результаты под окном графиков). Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу со значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

Таблица 27

Параметры анализа результатов по различным каналам при использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Канал детекции	Порог	Устранение выбросов	Коррект. уклона
Green	0,1	0	выключена
Yellow	0,1	5	выключена
Orange	0,1	5	выключена
Crimson	0,1	5	выключена
Red	0,07	5	включена

Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма отсутствует значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО (каналу Red для тестов первой группы, каналу Orange - для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации ДНК анализируемых микроорганизмовне определено значение порогового цикла Ct и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
3. Для автоматизированного учета результатов некоторых тестов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп. 1-3, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 28 и 29).

Таблица 28

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

При использовании наборов группы 1
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Ct по каналам Green, Yellow, Orange и Crimson (если используется)	Ct по каналу Red
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение < 33
При использовании наборов группы 2
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Сt по каналам Green, Yellow	Сt по каналу Orange
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение < 33

Таблица 29

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля (ПКО)

Набор (тест), группа 1	Граничное значение Ct по каналу
Набор (тест), группа 1	Green	Yellow	Orange	Crimson	Red
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium/ T.vaginalis	35	35	35	33	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium/ M.hominis	35	35	35	33	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium	30	33	33	-	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	30	33	33	-	33
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	33	30	33	-	33
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	33	33	33	-	33
Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»
U. parvum / U. Urealyticum	33	33	33	-	-
HSV –typing	33	30	33	-	-
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	33	33	33	-	-
HSV / CMV	30	30	33	-	-

Пример полученных результатов:
Результаты, полученные с использованием набора «АмплиСенс® C.trachomatis/ Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу Red (канал для ВКО) менее 33. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных значений. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образце 2 обнаружены ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу Green (здесь – Chlamydia trachomatis), и ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу Yellow (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу Yellow (здесь – Ureaplasma spp.), и по каналу Orange (здесь - Mycoplasma hominis).
- В образце 7 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу Yellow (здесь – Ureaplasma spp.).
- Для всех образцов, кроме образца 5, по каналу Red определены значения Ct менее 33.
- В образцах 1, 4 и 6 не обнаружены ДНК ни одного из выявляемых микроорганизмов
- Для образца 5 получен невалидный результат (отсутствуют значения Ct по всем каналам), требуется повторение анализа этого образца.

В2. Анализ результатов при использовании программы для «Rotor-Gene» 3000 и программы «Rotor-Gene» 6000 (или «Rotor-Gene Q») с англоязычным интерфейсом
Далее по тексту термины, соответствующие разным моделям приборов, указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для прибора «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q» (если термины совпадают для разных моделей прибора, то указан один термин).
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам – по каналу FAM/Green регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма, по каналу JOE/Yellow регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

Выбрать в главном меню значок меню Analysis, в ниспадающем меню выбрать вкладку Quantitationи выбрать в списке нужный канал. Выполнить операцию для данных канала FAM/Green, выбрав в поле «CyclingAFAM»/«CyclingAGreen», затем для данных канала JOE/Yellow, выбрав в поле «CyclingAJOE»/«CyclingAYellow».
Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, регистрируемых по каналу JOE/Yellow.

2.1 Выбрать график нормализованных кривых флуоресценции по каналу JOE/Yellow.
2.2 В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube (включена по умолчанию). Включить в меню над графиками кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %).
2.3 Задать уровень пороговой линии: в меню CTCalculation ввести в текстовом поле Threshold значение 0,1.
2.4 В таблице результатов по каналуJOE/Yellow будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Quant. Resultes – Cycling A. JOE»/«Quant. Resultes – CyclingA. Yellow» под окном графиков).

Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК микроорганизма, регистрируемых по каналу FAM/Green.

3.1 Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу FAM/Green.
3.2 В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube (включена по умолчанию). Кнопка Коррект. уклонадолжна быть выключена или включена в соответствии c табл. 30 для используемого набора реагентов. Включить кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение, указанное в табл. 30 для используемого набора реагентов.
3.3 Задать уровень пороговой линии: в меню CTCalculation ввести в текстовом поле Threshold значение 0,1.

3.4 В таблице результатов по каналуFAM/Green будут указаны значения порогового цикла Ct для каждого образца (окно «Quant. Resultes – Cycling A FAM»/«Quant. Resultes – Cycling A. Green» под окном графиков).

Таблица 30

Параметры анализа результатов по каналу FAM/Green

Наименование набора реагентов	Threshold	More Settings/ Outlier Removal	Slope Correct
*Chlamydia trachomatis*	0,1	0	выключена
*Neisseria gonorrhoeae-скрин*	0,1	0	выключена
*Neisseria gonorrhoeae-тест*	0,1	0	выключена
*Neisseria gonorrhoeae*	0,1	0	выключена
*Mycoplasma genitalium*	0,1	0	выключена
*Ureaplasma species*	0,1	0	выключена
*Mycoplasma hominis*	0,1	0	выключена
*HSVI, II*	0,1	0	выключена
*CMV*	0,1	0	выключена
*Gardnerella vaginalis*	0,1	0	выключена
*Treponema pallidum*	0,1	5	включена
*Trichomonas vaginalis*	0,1	5	включена
*Candida albicans*	0,1	0	выключена

Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green определено значение порогового цикла Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green не определено (отсутствует) значение Ct (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение Ct, не превышающее граничного значения 30.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green не определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу JOE/Yellow значение Ctтакже отсутствует или превышает 30. В этом случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК..
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 31 и 32).

Таблица 31

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Ct
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналу FAM/Green	по каналу для флуорофора JOE/Yellow
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение <30
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение <30

Таблица 32

Граничные значения порогового цикла по каналу Green для положительного контроля

Наименование ПЦР-комплекта-FRT	Граничное значение Сt по каналу Green для «К+»
Chlamydia trachomatis	30
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	33
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae(1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагментов ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в табл. 20, согласно инструкции по его применению (каналы FAM/Green, или JOE/Yellow, или ROX/Orange, или Crimson). Результаты амплификации ДНК ВКО регистрируются при использовании наборов первой группы - по каналу Cy5/Red, а при использовании наборов второй группы («дуплексов») - по каналу ROX/Orange.
Результаты интерпретируются на основании данных, полученных по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ВКО, согласно табл. 20 (раздел «Анализ и интерпретация результатов»).
1. Чтобы проанализировать данные по определенному каналу, нужно выбрать в главном меню значок меню Analysis, в ниспадающем меню выбрать вкладку Quantitationи необходимый канал (например, канал FAM/Green - «CyclingAFAM»/«CyclingAGreen», канал JOE/Yellow - «CyclingAJOE»/«CyclingAYellow» и т.д.).
2. Анализ результатов амплификации ДНК ВКО.
2.1 Для первой группы тестов: выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу Cy5/Red. В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube(включена по умолчанию). Включить кнопку SlopeCorrect, затем включить кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии – в меню CTCalculation ввести в текстовом поле Threshold значение 0,07. В таблице результатов по каналу Cy5/Redбудут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно «Quant. Results – Cycling A. Cy5»/«Quant. Results – Cycling A. Red» под окном графиков).
2.2 Для второй группы тестов («дуплексов»): выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по каналу ROX/Orange. В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube(включена по умолчанию). Включить в меню над графиками кнопку SlopeCorrect, затем включить кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии – в меню CTCalculation ввести в текстовом поле Порог значение 0,1. В таблице результатов по каналу ROX/Orangeбудут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно«Quant. Results – Cycling A. ROX»/«Quant. Results – Cycling A. Orange» под окном графиков).
3. Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК микроорганизмов.
Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:
3.1 Выбрать в главном меню значок меню Analysis, в ниспадающем меню выбрать вкладку Quantitationи выбрать в списке нужный канал.
3.2 Выбрать окно нормализованных графиков флуоресценции по данному каналу.
3.3 В меню над графиками должна быть включена кнопка DynamicTube (включена по умолчанию). Кнопка SlopeCorrectдолжна быть выключена или включена в соответствии с указанным в табл. 33 вариантом для данного канала (включена – для канала Crimson, выключена – для всех остальных). Включить кнопку MoreSettings/OutlierRemoval и ввести в текстовом поле значение, указанное в табл. 33 для данного канала.
3.4 Задать уровень пороговой линии: – в меню CTCalculationввести в текстовом поле Threshold значение 0,1.
3.5 В таблице результатов по данному каналу будут указаны значения порогового цикла Ct для каждой пробы (окно Quant. Results под окном графиков).
Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу со значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

Таблица 33

Канал детекции	Threshold	More Settings/ Outlier Removal	Slope Correct
FAM/Green	0,1	0	выключена
JOE/Yellow	0,1	5	выключена
ROX/Orange	0,1	5	выключена
Crimson (если используется)	0,1	5	выключена
Cy5/Red	0,07	5	включена

4. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма отсутствует значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО (каналу Сy5/Red для тестов первой группы, каналу ROX/Orange для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации результатов амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмане определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
5. Для автоматизированного учета результатов некоторых тестов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <(сокращенное название набора)> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп.1-2, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 34 и 35).

Таблица 34

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

При использовании наборов для выявления 3 или 4 микроорганизмов (группа 1)
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Ct по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange и Crimson (если используется)	Ct по каналу Cy5/Red
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение < 33
При использовании наборов для выявления 2 микроорганизмов (группа 2)
B-	Выделение ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение < 33

Таблица 35

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля

Набор (тест), группа 1		Граничное значение Ct по каналу
Набор (тест), группа 1	FAM/Green		JOE/Yellow	ROX/Orange	Cy5/Red	Crimson
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium/ T.vaginalis	35		35	35	33	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium/ M.hominis	35		35	35	33	33
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium	30		33	33	33	-
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	30		33	33	33	-
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	33		30	33	33	-
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	33		33	33	33	-
Набор (тест), группа 2 – «дуплексы»
U. parvum / U. Urealyticum	33		33	33	-	-
HSV-typing	33		30	33	-	-
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	33		33	33	-	-
HSV / CMV	30		30	33	-	-

Пример полученных результатов:
Результаты, полученные с использованием набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу Cy5/Red (канал для ВКО) менее 33. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных значений. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образце 2 обнаружены ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу FAM/Green (здесь – Chlamydia trachomatis), и ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу Yellow (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу JOE/Yellow (здесь – Ureaplasma spp.) и по каналу ROX/Orange (здесь - Mycoplasma hominis).
- В образце 7 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу JOE/Yellow (здесь – Ureaplasma spp.).
- Для всех образцов, кроме 5-го, по каналу Red определены значения Ct менее 33.
- Для образца 5 получен невалидный результат - отсутствуют значения Ct по всем каналам.

- В образцах 1, 4 и 6 не обнаружены ДНК ни одного из выявляемых микроорганизмов.

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «iQ iCycler» или «iQ5»

Назначить для выполнения универсальную программу амплификации и детекции «АмплиСенс-1» (табл. 36).

Таблица 36

Программа «АмплиСенс-1» для приборов «iQ iCycler» или «iQ5»

Цикл	Температура, °С	Время	Кол-во циклов
1	95	15 мин	1
2	95	5 с	5
	60	20 с
	72	15 с
3	95	5 с	40
	60	30 с *детекция флуоресц.сигнала
	72	15 с

Для этого выбрать или создать эту программу в модуле Protocol (ViewProtocolsдля«iQ iCycler»).Для«iQ iCycler» назначить программу к выполнению, нажав кнопку RunwithselectedPlateSetup.
Программа «АмплиСенс-1» является универсальной для проведения амплификации и детекции при использовании комплектов реагентов «ПЦР-комплект» производства ФГУН ЦНИИЭ для выявления ДНК возбудителей ИППП. Поэтому можно одновременно в одном приборе проводить все эти тесты или любое их сочетание, включая все тесты для выявления и генотипирования вирусов папилломы человека (ВПЧ ВКР) с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» производства ФГУН ЦНИИЭ.
ВНИМАНИЕ! Для прибора «iQ iCycler» не рекомендуется одновременно выполнять амплификацию и детекцию с использованием наборов в формате «МУЛЬТИПРАЙМ» и наборов для выявления одного микроорганизма (т.е. тесты, в которых используются разные комбинации детектируемых каналов). Если требуется выполнять такие тесты одновременно, то необходимо при запуске выбрать для измерения факторов лунок вариант External Well Factors Plate и использовать для процедуры запуска набор пробирок со специальным раствором «External Well Factor Solution» (производства «Bio-Rad»).
ВНИМАНИЕ! Для прибора «iQ iCycler» необходимо проверить, чтобы протокол dynamicwf.tmo соответствовал стандартному, как показано на рисунке. Если этот протокол был изменен и не соответствует указанному, его необходимо исправить.
Протокол dynamicwf.tmo для прибора « iQ iCycler»:

Задать схему планшета – расположение пробирок в модуле и детекцию флуоресцентного сигнала во всех пробирках по нужным каналам в окне Edit PlateSetupмодуля Workshop. При использовании наборов реагентов для выявления одного микроорганизма назначить детекцию по каналам FAM и HEX. При использовании наборов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» назначить детекцию по каналам FAM, HEX, ROX и Cy5. Сохранить схему планшета. Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.
Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне SelectedPlateSetupмодуля Workshopнажать кнопку CreateNew или Edit. Редактировать схему планшета в режиме WholePlateloading. Чтобы включить второй флуорофор, необходимо использовать пиктограмму над схемой.Задать объем реакции (SampleVolume): 30 мкл, тип крышек (SealType): DomedCap, тип пробирок (VesselType): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&ExitPlateEditing.
Для прибора «iQ iCycler» отредактировать схему планшета в окне Edit PlateSetup модуля Workshop и назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.
При работе с «ПЦР-комплектами» вариант FRT (с использованием прослойки воска для горячего старта) перейти к пункту 4. При работе с «ПЦР-комплектами» вариант FRT-100 F и FRT-1000 F (с использованием химически модифицированной Taq-полимеразы – TaqF) поставить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора.
Запустить выполнение выбранной программы «АмплиСенс-1» с заданной схемой планшета.

- Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы анализа следует проверить правильность выбранного протокола (SelectedProtocol) и схемы планшета (SelectedPlateSetup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Use PersistentWellFactors(предлагается по умолчанию).
- Для прибора «iQ iCycler» перед запуском выполнения программы в окне RunPrep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета. Выбрать под строкой Selectwellfactorsource вариант ExperimentalPlate(предлагается по умолчанию) для измерения факторов лунок (cм. примечание в п.1).Задать объем реакционной смеси – 30 мкл. Для запуска нажать кнопку Run.

При работе с ПЦР-комплектами вариант FRT-100F и FRT-1000 F перейти к пункту 6.

При работе с ПЦР-комплектами вариант FRT (с использованием прослойки воска для горячего старта) после того, как температура реакционного блока достигнет 95 °С, нажать кнопку Pause, открыть крышку и поместить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора и нажать кнопку Resume Run для прибора «iQ5» (кнопку Continue Running Protocol для «iQ iCycler»).

После окончания выполнения программы можно приступить к анализу результатов.
По окончании работы с прибором необходимо закрыть программу и выключить прибор (амплификатор и блок оптической системы).

Анализ результатов, полученных при использовании приборов «iQ5» или «iQ iCycler»

Полученные данные интерпретируются с помощью программного обеспечения прибора «iQ5» или «iQ iCycler». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения графика флуоресценции данного образца с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
- по каналу HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма.

Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM (для «iQ iCycler» выбрать значок канала FAM-490 в окне SelectaReporter). При этом должен быть выбран режим анализа данных PCRBaseLineSubtractedCurveFit(выбирается по умолчанию).
Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

Чтобы выделить график образца «К+» (или другого желаемого образца), можно воспользоваться кнопкой DisplayWells (Selectwells), либо установить курсор на графике этого образца и сделать двойной щелчок.

Для прибора «iQ5»: чтобы установить уровень пороговой линии, необходимо либо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать меню BaselineThreshold(в ниспадающем меню, вызываемом щелчком правой кнопки мыши по окну графиков флуоресценции), затем выбрать опцию UserDefinedи ввести нужное значение в текстовом поле ThresholdPosition. Чтобы вывести на экран полную таблицу результатов, нажать кнопку Results.
Для прибора «iQ iCycler»: чтобы изменить уровень пороговой линии, необходимо либо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать опцию UserDefinedи ввести нужное значение в текстовом поле ThresholdPosition. После этого нажать кнопку RecalculateThresholdCycles.

Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать также при последующих анализах результатов с помощью данного набора при условии, что не производилась новая калибровка прибора.

Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, регистрируемых по каналу HEX.
Выполнить аналогичную операцию для данных по каналу HEX (для «iQ iCycler» выбрать значок канала HEX-530 в окне SelectaReporter). При этом должен быть выбран режим анализа данных PCRBaseLineSubtractedCurveFit(выбирается по умолчанию). Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать также при анализе результатов амплификации ВКО в других тестах, выполненных с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) для выявления ДНК возбудителей ИППП. Тот же уровень порога по каналу HEX можно использовать и при последующих анализах с помощью данного набора при условии, что не производилась новая калибровка прибора.

Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице пороговых циклов по каналу FAM определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данного образца должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице в пороговых циклов по каналу FAM в графе Ct указывается значение N/A (отсутствует пересечение графика флуоресценции с пороговой линией), а в таблице пороговых циклов по каналу HEX для него определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы отсутствует (не определено) значение порогового цикла Ct (т.е. указано N/A) по каналу FAM и по каналу HEX значение Ctтакже отсутствует (N/A) или превышает 33. В этом случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 37 и 38).

Таблица 37

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналу FAM	по каналу HEX
В-	Экстракция ДНК	N/A (отсутствует)	Определено значение <33
К-	ПЦР	N/A (отсутствует)	N/A (отсутствует)
K+	ПЦР	Определено значение <граничного	Определено значение <33

Таблица 38

Граничные значения порогового цикла по каналу FAM для положительного контроля

Наименование набора реагентов	Граничное значение Сt по каналу FAM для «К+»
Chlamydia trachomatis	33
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	36
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

Пример полученных результатов для прибора «iQ5»:

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу HEX (канал для ВКО) менее 33. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по каналу FAM не превышает граничного значения. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 1, 4 и 5 обнаружена ДНК анализируемого микроорганизма.
- Во всех образцах, кроме образца 3, определено значение Ct по каналу HEX, не превышающее граничного значения 33.
- В образцах 2 и 6 не обнаружена ДНК анализируемого микроорганизма.
- Для образца 3 получен невалидный результат – отсутствуют значения Ct по обоим каналам, требуется повторение анализа этого образца.
Пример полученных результатов для прибора «iQ iCycler»:

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct по каналу HEX (канал для ВКО) менее 33. Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по каналу FAM не превышает граничного значения. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В пробе 10 (B3) обнаружена ДНК анализируемого микроорганизма;
- В пробах 9, 11-15 не обнаружена ДНК микроорганизма.

При использовании комплектов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагмента ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в инструкции по его применению и в табл. 20 (каналы FAM, или HEX (для флуорофора JOE), или ROX). Результаты амплификации ДНК ВКО при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов регистрируются по каналу Cy5, а при использовании наборов для выявления двух микроорганизмов («дуплексов») - по каналу ROX.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия значений пороговых циклов Ct по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО, согласно табл. 20 (раздел «Анализ и интерпретация результатов»).

Анализ результатов амплификации ДНК ВКО.

Выбрать в окне модуля анализа данные по каналу, назначенному для ВКО: при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов – канал Cy5 (для «iQ iCycler» выбрать значок канала Cy5-635 в окне SelectaReporter), при использовании наборов длявыявления двух микроорганизмов («дуплексов») канал ROX (для «iQ iCycler» выбрать значок канала ROX-575 в окне SelectaReporter). При этом должен быть выбран режим анализа данных PCRBaseLineSubtractedCurveFit(выбирается по умолчанию).
Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

Для прибора «iQ5»: чтобы установить уровень пороговой линии, нужно либо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать меню BaselineThreshold(в ниспадающем меню, вызываемом щелчком правой кнопки мыши по окну графиков флуоресценции), затем выбрать опцию UserDefinedи ввести нужное значение в текстовом поле ThresholdPosition. Чтобы вывести на экран полную таблицу результатов, нажать кнопку Results.
Для прибора «iQ iCycler»: чтобы изменить уровень пороговой линии, нужно либо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать опцию UserDefinedи ввести нужное значение в текстовом поле ThresholdPosition. После этого нажать кнопку RecalculateThresholdCycles.

Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать также при при последующих анализах результатов с помощью данного набора при условии, что не производилась новая калибровка прибора.

Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК микроорганизмов.

Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:

Выбрать в окне модуля анализа соответствующий канал (для «iQ iCycler» выбрать значок канала в окне SelectaReporter). При этом должен быть выбран режим анализа данных PCRBaseLineSubtractedCurveFit(выбирается по умолчанию).
Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.
Для удобства интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу со значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

3. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма отсутствует значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО (каналу Сy5 для тестов первой группы, каналу ROX для тестов второй группы), определено значение Ct, не превышающее граничного значения 36.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмовне определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 36. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца начиная с этапа экстракции ДНК.
3. Для автоматизированного учета результатов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп. 1-2, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 39 и 40).

Таблица 39

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации амплификации ДНК ВКО (Cy5 или ROX)
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 36
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение < 36

Таблица 40

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля

Набор (тест)	Граничное значение Ct по каналу
Набор (тест)	FAM	HEX	ROX
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium	33	36	36
C.trachomatis/Ureaplasma/ M.hominis	33	36	36
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/M.genitalium	36	33	36
C.albicans/ C.glabrata/C. krusei	36	36	36
U. parvum/ U. Urealyticum	36	36	36
HSV-typing	36	33	36
T.vaginalis/ N.gonorrhoeae	36	36	36
HSV/ CMV	33	33	36

Пример результатов, полученных для прибора «iQ 5» при использовании набора реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»:

Результаты, полученные с использованием набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct<36 по каналу Cy5 (канал для ВКО). Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- Для всех образцов, кроме образца 5, по каналу Сy5 определены значения Ct менее 36
- В образце 2 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются соответственно по каналу FAM (здесь – Chlamydia trachomatis), и - по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.).
- В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются соответственно по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.), и - по каналу ROX (здесь - Mycoplasma hominis).
- В образце 4 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
- Для образца 5 получен невалидный результат - отсутствуют значения Ct по всем каналам.

- В образцах 1, 5 и 6 не обнаружены ДНК ни одного из анализируемых микроорганизмов.

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании прибора «ДТ-96»

А. Создание шаблона теста
Выбрать меню Tест, затем Создать/Редактировать тест. В открывшемся окне выбрать Создать новый тест. Задать (выбрать) следующие параметры теста:

Тип – Качественный, Метод – Пороговый (Ct);
Объем рабочей смеси в пробирке - 30 мкл;
Флуорофоры: FAM, HEX, ROX – Cпецифика, Cy5 – ВКО;
Программа амплификации – AmpliSens-1 (отредактированная в соответствии с табл. 41):

Таблица 41

Программа амплификации AmpliSens-1

Цикл	Температура, °С	Время	Кол-во циклов
1	95	15 мин	1
2	95	5 с	5
	60	20 с
	72	15 с
3	95	5 с	40
	60	30 с *детекция флуоресц.сигнала
	72	15 с

Нажать кнопку OK для сохранения теста.

Б. Проведение амплификации и детекции с использованием шаблона теста

В меню Протокол нажать кнопку Добавить тест, задать количество исследуемых образцов и контролей («К+» и «К-»).
Задать схему расположения образцов в реакционном блоке, указав для каждого образца его идентификатор. Нажать кнопку Применить.
При использовании только наборов реагентов для выявления одного микроорганизма достаточно назначить детекцию по каналам FAM – Специфика и HEX – ВКО. Можно отключить детекцию по другим каналам (ROX, Cy5), указав для них тип флуорофора - Отсутствует.
Открыть реакционный блок с помощью кнопки Открыть блок и поставить реакционные пробирки в ячейки блока в соответствии с предварительно заданной в протоколе схемой расположения пробирок. Закрыть блок с помощью соответствующей кнопки.
В меню Запуск программы амплификации проверить правильность выбранной программы амплификации (AmpliSens-1) и объема реакционной смеси (30 мкл), заданных в шаблоне теста. Запустить выполнение программы амплификации и детекции, нажав кнопку Запуск программы.

В. Анализ результатов, полученных при использовании прибора «ДТ-96»

Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения прибора «ДТ-96». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции данного образца с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
- по каналу HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

Выбрать в выпадающем списке Тип анализа пункт Качественный.
Выбрать Метод – Пороговый (Сt)
Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма.
3.1 Выбрать канал FAM в списке выбора оптического канала.

3.2 Установить пороговую линию на 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» в последнем цикле амплификации. При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
Чтобы установить пороговую линию необходимо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши. Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца), можно выделить данный образец в окне Результаты.

Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК ВКО.

Выполнить аналогичные операции для данных по каналу HEX.

Выбрать канал HEX в списке Выбор оптического канала.
Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации.

5. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM определено значение Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должен пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM не определено (отсутствует) значение порогового цикла Сt (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу HEX определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM не определено значение порогового цикла Ct и в таблице результатов по каналу HEX значение Ctтакже отсутствует или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 42 и 43).

Таблица 42

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналу FAM	по каналу HEX
B-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение <33
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение <33

Таблица 43

Граничные значения порогового цикла по каналу FAM для положительного контроля

Наименование набора реагентов	Граничное значение Сt по каналу FAM для «К+»
Chlamydia trachomatis	33
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	36
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

При использовании наборов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагмента ДНК микроорганизмарегистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов в табл. 20 и в инструкции по его применению (каналы FAM, или HEX, или ROX). Результаты амплификации ДНК ВКО при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов регистрируются по каналу Cy5, а при использовании наборов для выявления двух микроорганизмов («дуплексов») - по каналу ROX.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия значений пороговых циклов Ct по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО, согласно табл. 20 (раздел «Анализ и интерпретация результатов»).

Выбрать в выпадающем списке Тип анализа пункт Ct(Cp) для всех каналов.
Выбрать Метод – Пороговый (Сt).
Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов.

Выбрать нужный канал в списке выбора оптического канала.
Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
Чтобы установить пороговую линию, необходимо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши. Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца), нужно выделить данный образец в окне Результаты.
Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу с полученными значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

4. Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК ВКО.

Выбрать в списке канал, назначенный для ВКО: при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов – канал Cy5, при использовании наборов длявыявления двух микроорганизмов («дуплексов») – канал ROX.
Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации. При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу с полученными значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

5. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должен пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма не определено (отсутствует) значение порогового цикла Сt (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для ВКО (канал Сy5 для тестов первой группы, канал ROX для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 36.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмане определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 36. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
6. Для автоматизированного учета результатов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп.1-4, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.

Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 44 и 45)

Таблица 44

Результаты контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации результатов амплификации ДНК ВКО (Cy5 или ROX)
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 36
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение < 36

Таблица 45

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля ПЦР

Набор (тест)	Граничное значение Ct по каналу
Набор (тест)	FAM	HEX	ROX
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium	33	36	36
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	33	36	36
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	36	33	36
C.albicans/ C.glabrata/ C. Krusei	36	36	36
U. parvum / U. Urealyticum	36	36	36
HSV –typing	36	33	36
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	36	36	36
HSV / CMV	33	33	36

Пример результатов, полученных на приборе «ДТ-96»:
Результаты, полученные при использовании набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-»
и «К-» - отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct<36 по каналу Cy5 (канал для ВКО). Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 6 и 7 не обнаружены ДНК ни одного из микроорганизмов, по каналу Сy5 определены значения Ct менее 36.
- В образце 1 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу FAM (здесь – Chlamydia trachomatis) и по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образце 4 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются. cоответственно, по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.) и по каналу ROX (здесь – Mycoplasma hominis).
- Для образца 5 получен невалидный результат – отсутствуют значения Ct по всем каналам.

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «Mx3000P» или «Mx3005P»

Задать схему планшета – расположение пробирок в модуле и детекцию флуоресцентного сигнала во всех пробирках по используемым каналам в окне PlateSetup. Все образцы обозначить значком Unknown, отметить галочкой имена флуорофоров, которые нужно детектировать, нажать кнопку Showwellnames и ввести имя образца в каждую ячейку. При использовании наборов реагентов для выявления одного микроорганизма назначить детекцию по каналам FAM и JOE. При использовании наборов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ» назначить детекцию по каналам FAM, JOE, ROX и Cy5.
Назначить для выполнения на амплификаторе «Mx3000P» или «Mx3005P» универсальную программу амплификации и детекции «АмплиСенс-1 Mx». Для этого выбрать или создать эту программу в модуле ThermalProfileSetup, затем сохранить файл с выбранной программойи схемой планшета, и запустить выполнение программы, нажав кнопку Run.

Программа «АмплиСенс-1»:
Segment 1– 1 Cycle: 95 °С – 15 мин
Segment 2 – 5 Cycles: 95 °С – 5 с/ 60 °С – 20 с/ 72 °С – 15 с
Segment 3 – 40 Cycles: 95 °С – 5 с/ 60 °С – 30 с */ 72 °С – 15 с
* - детекция флуоресценции на втором шаге (60 °С) второго блока циклирования (Segment 3).
С использованием универсальной программы «Амплисенс-1» можно одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» производства ФГУН ЦНИИЭ, включая все тесты для выявления и генотипирования вирусов папилломы человека.

Поставить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора.
Рекомендуется перед стартом включить (отметить галочкой) опцию выключения лампы после окончания выполнения программы.
После окончания программы можно приступить к учету результатов.
По окончании работы с прибором необходимо закрыть программу и выключить прибор.

Анализ результатов, полученных при использовании приборов «Mx3000P» или «Mx3005P»

Полученные данные анализируются с помощью программного обеспечения прибора «Mx3000P» или «Mx3005P». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции данного образца с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
- по каналу JOE регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.
1. Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма.
Выбрать в окне Results / Amplification Plots модуля Analysis данные по каналу FAM. Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.
Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца) в окне AnalysisSelection/Setup, выберите ячейку, соответствующую этому образцу, и снова переключитесь в окно Results.
Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать и при учете результатов амплификации ДНК данного возбудителя при последующих анализах с помощью данного набора.
2. Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, регистрируемых по каналу JOE.
Выполнить аналогичную операцию для данных канала JOE. Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.
Примечание. Выбранный уровень порога можно использовать и при анализе результатов амплификации ВКО в других тестах для выявления ДНК одного из возбудителей ИППП, выполненных с помощью наборов реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ. Тот же уровень порога по каналу JOE можно использовать и при последующих анализах с помощью данного набора.
3. Для получения суммарной таблицы результатов (пороговых циклов) включите в окне Results / AmplificationPlots данные по обоим каналам и выберите в меню в списке опций Areatoanalyze опцию TextReport. Полученную таблицу результатов можно экспортировать в Excel (для этого щелчком правой кнопки мыши вызвать меню и выбрать в нем пункт ExportTextReporttoExcel).
4. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице пороговых циклов по каналу FAM (при выбранном значке канала FAM-490 в окне SelectaReporter) для этого образца определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данного образца должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице в пороговых циклов по каналу FAM в графе Ct для него указывается значение N/A (не детектируется пересечение кривой флуоресценции с пороговой линией), а в таблице пороговых циклов по каналу JOE для него определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено значение порогового цикла Ct, т.е. указано N/A, по каналу FAM и по каналу JOE значение Ctтакже отсутствует (N/A) или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 46 и 47).

Таблица 46

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналу FAM	по каналу JOE
В-	Экстракция ДНК	N/A (отсутствует)	Определено значение <33
К-	ПЦР	N/A (отсутствует)	N/A (отсутствует)
K+	ПЦР	Определено значение < граничного	Определено значение <33

Таблица 47

Граничные значения порогового цикла по каналу FAM для положительного контроля ПЦР

Наименование набора реагентов	Граничное значение Сt по каналу FAM для «К+»
Chlamydia trachomatis	33
HSVI, II
CMV
Candida albicans
Neisseria gonorrhoeae-скрин	36
Neisseria gonorrhoeae-тест
Neisseria gonorrhoeae (1-я и 2-я реакции)
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Treponema pallidum
Ureaplasma species
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis

Анализ результатов амплификации ДНК ВКО.

Выбрать в окне Results/ AmplificationPlots модуля Analysis данные по каналу, назначенному для ДНК ВКО: канал Cy5 – при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов, канал ROX – при использовании наборов для выявления двух микроорганизмов («дуплексов»).
Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца), выберите этот образец в списке результатов справа от окна AmplificationPlots и снова переключитесь в окно Results. Чтобы включить снова все анализируемые образцы, следует нажать кнопку Selectall справа внизу (под списком результатов)

Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов.

Выбрать нужный канал в окне Results / AmplificationPlots модуля Analysis.
Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон.

3. Для получения суммарной таблицы результатов (пороговых циклов) по всем каналам включите в окне Results / AmplificationPlots данные по всем каналам и выберите в меню в списке опций Areatoanalyze опцию TextReport. Полученную таблицу результатов можно экспортировать в Excel (для этого щелчком правой кнопки мыши вызвать меню и выбрать в нем пункт ExportTextReporttoExcel).
4. Результаты интерпретируются следующим образом:
А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должен пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма не определено (отсутствует) значение порогового цикла Сt (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для ВКО (канал Сy5 для тестов первой группы, канал ROX для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 36.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмане определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 36. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
5. Для автоматизированного учета результатов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов в соответствии с пп. 1-3; полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов в буфер обмена и вставить в соответствующую графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.

Таблица 48

Результаты контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла, Сt
Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	по каналам для регистрации результатов амплификации ДНК микроорганизмов	по каналу для регистрации амплификации ДНК ВКО (Cy5 или ROX)
В-	Экстракция ДНК	Значение отсутствует	Определено значение < 36
К-	ПЦР	Значение отсутствует	Значение отсутствует
K+	ПЦР	Определено значение меньше граничного	Определено значение < 36

Таблица 49

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля ПЦР

Набор (тест)	Граничное значение Ct по каналу
Набор (тест)	FAM	HEX	ROX
C.trachomatis/Ureaplasma / M.genitalium	33	36	36
C.trachomatis/Ureaplasma / M.hominis	33	36	36
N.gonorrhoeae/ C.trachomatis/ M.genitalium	36	33	36
C.albicans/ C.glabrata/ C. krusei	36	36	36
U. parvum / U. Urealyticum	36	36	36
HSV –typing	36	33	36
T.vaginalis / N.gonorrhoeae	36	36	36
HSV / CMV	36	36	36

Пример результатов, полученных при использовании прибора «Mx3000P»:
Результаты, полученные с применением набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

- Результат для отрицательных контролей «B-» и «К-» -- отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct<36 по каналу Cy5 (канал для ВКО). Результат для положительного контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
- В образцах 2, 3 и 6 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу JOE (здесь – Ureaplasma spp.). В образце 3 также обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу ROX (здесь – Mycoplasma hominis)
- В образце 5 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу FAM (здесь – Chlamydia trachomatis), и - по каналу JOE (здесь – Ureaplasma spp.)
- В образцах 1 и 4 не обнаружены ДНК выявляемых микроорганизмов. Значения Ct по каналу Сy5 (канал для ВКО) для них не превышают граничного значения 36.

Возврат к списку

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПРИНЦИП МЕТОДА

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

А. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-АМ»

Подготовка к проведению экстракции ДНК

Б. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-B»

Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) следует прогреть, перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ, АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ ПО «КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ» - ВАРИАНТ FEP

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ПО «КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ»

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ПРОВЕДЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИИ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ПЦР-ДЕТЕКТОРОВ

Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании прибора «АЛА-1/4»

Для программы ALA1 версии 5.1.0 и выше

А. Проведение флуоресцентной детекции

Б. Интерпретация результатов

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов для выявления ДНК одного микроорганизма

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Для программы ALA1 версии до 5.1.0

А. Проведение флуоресцентной детекции

Б. Интерпретация результатов

Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании приборов «ДЖИН» или «ДЖИН-4»

А. Проведение детекции

Б. Интерпретация результатов

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов для выявления ДНК одного микроорганизма

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании приборов «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q»

В. Интерпретация результатов

Интерпретация результатов, полученных при использовании наборов для выявления ДНК одного микроорганизма

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» - ВАРИАНТ FRT

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ C ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»

АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ПРИБОРОВ

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «Rotor-Gene» 3000 или 6000 или «Rotor-Gene Q»

В. Анализ результатов, полученных при использовании приборов «Rotor-Gene» 3000 или 6000 и «Rotor-Gene Q»

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «iQ iCycler» или «iQ5»

Анализ результатов, полученных при использовании приборов «iQ5» или «iQ iCycler»

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании прибора «ДТ-96»

Б. Проведение амплификации и детекции с использованием шаблона теста

В. Анализ результатов, полученных при использовании прибора «ДТ-96»

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «Mx3000P» или «Mx3005P»

Анализ результатов, полученных при использовании приборов «Mx3000P» или «Mx3005P»