8 (800) 100-28-84 (бесплатно для звонков по РФ)

Количественное исследование Chlamydia trachomatis в клиническом материале методами культуры клеток и ПЦР «в реальном времени»

Меню
Категории

Количественное исследование Chlamydia trachomatis в клиническом материале методами культуры клеток и ПЦР «в реальном времени»

Введение: Chlamydia trachomatis - внутриклеточный паразит, который относят к безусловно патогенными микроорганизмам. В развитых странах наиболее широко распространены серотипы C. trachomatis, вызывающие урогенитальную хламидийную инфекцию, которая, в первую очередь у женщин, может долгое время протекать с минимальными клиническими проявлениями, приводя к развитию восходящей инфекции с поражением органов малого таза. В связи с этим, выявление возбудителя является достаточным основанием для назначения антибактериальной терапии вне зависимости от выраженности клинических проявлений, а существующие рутинные лабораторные тесты  диагностики инфекции носят качественный характер. В тоже время в ряд зарубежных исследований свидетельствует о том, что уровень бактериальной нагрузки может иметь определенное клиническое (патогенетическое, прогностическое) значение. В частности, в работе [Brunham R.C., et al, 1983] было показано, что уровень секреторных анти-C. trachomatis IgA играющих значительную роль в элиминации хламидийной инфекции, имеет обратную зависимость от концентрации возбудителя в цервикальном канале. В работе [Geisler W.M., et al., 2001] была установлена связь между бактериальной нагрузкой C. trachomatis с уровнем воспалительной реакции и клиническими проявлениями инфекции.   Наконец, существует точка зрения, что рецидив хламидийной инфекции, не связанный с повторным инфицированием после проведенной антибактериальной терапии, вызван развитием гетеротипической устойчивости в результате высокой бактериальной нагрузки до начала лечения. В связи с этим, количественное определение возбудителя может иметь большое значение в выборе тактики этиотропной терапии [Horner P. Et al, 2006]. Однако описанные методы количественного определения C. trachomatis в большинстве работ были основаны на методе культуры клеток, который, как известно, трудоемок и трудно поддается стандартизации. Технология ПЦР с детекцией продуктов амплификации в реальном времени (Real-Time PCR) дает возможность разработать рутинный лабораторный тест для количественной оценки содержаний С. trachomatis в клиническом материале, отражающий уровень бактериальной нагрузки.

Целью настоящего исследования явилась разработка теста на основе метода ПЦР «в реальном времени» для определения концентрации ДНК C.trachomatis  в клиническом образце и сравнение полученных результатов с методом культуры клеток.

Материал и методы: Клинические образцы (соскобы из цервикального канала женщин и уретры мужчин) собирали в пробирки с 1 мл сахарозо-фосфатного буфера и хранили до тестирования при минус 70ºС. Всего было исследовано 27 образцов. Для культивирования хламидий использовали монослои клеток McCoy в 96-луночных планшетах. Концентрацию хламидий в клиническом образце представляли как число включение образующих единиц (ВОЕ) в 1 мл пробы после подсчета количества хламидийных включений как минимум в 10 полях. 

Для проведения ПЦР с детекцией флуоресцентного сигнала в реальном времени были разработаны олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченные гибридизационные зонды, комплементарные к фрагменту генома C. trachomatis. Для количественной оценки были приготовлены ДНК-стандарты - разведения ДНК C. trachomatis с известной концентрацией, определенной методом предельных разведений [Rodrigo AG, 1997]. Амплификация с детекцией в реальном времени проводилась в приборе для Real-Time PCR Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Австралия). С помощью программного обеспечения к прибору относительно ДНК-стандартов рассчитывались неизвестные значения концентраций ДНК C. trachomatis в клинических образцах с учетом эффективности экстракции ДНК. Для учета эффективности экстракции ДНК C. trachomatis из клинических образцов был разработан рекомбнантный внутренний контрольный образец (ВКО) с известной концентрацией, добавляемый в каждый клинический образец. Экстракцию ДНК проводили с использованием набора ДНК-сорб-АМ производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Эффективность экстракции рассчитывалась как отношение концентрации ВКО, определенной после проведения пробоподготовки клинического образца к исходной концентрации ВКО.

Результаты: Количественные показатели определения C. trachomatis с помощью ПЦР в реальном времени и методом культуры клеток представлены в таблице.

 

Результаты количественного анализа клинических проб на Chlamydia trachomatis методами ПЦР в реальном времени и культуры клеток

№ пациента

ПЦР–РВ

ГЭ /мл *

Культура клеток,

ВОЕ/мл**

209

1х105

1х102

224

5х105

2х102

249

2х107

1х103

267

7х105

1х102

274

5х105

5х101

285

2х108

4х104

359

7х105

2х101

362

2х106

4х103

384

1х106

4х103

437

2х106

2х103

466

7х105

2х103

473

9х103

Отриц.

532

3х106

1х101

535

4х104

Отриц.

537

3х105

Отриц.

561

5х104

8х102

567

1х108

8х104

608

1х104

Отриц.

720

3х105

1х103

726

4х105

Отриц.

754

8х104

Отриц.

760

3х105

Отриц.

777

7х103

Отриц.

812

3х107

1х103

870

1х105

1х101

904

7х104

Отриц.

1020

1х107

4х104

 

* ПЦР-РВ – ПЦР в реальном времени, ГЭ/мл – геномные эквиваленты в 1 мл

 ** ВОЕ/мл – включения образующие единицы в 1 мл

Значение концентраций варьировало в интервале от 7х103 до 1х108 ГЭ в мл (среднее 5х105 ГЭ/мл). Сравнение полученных значений концентраций ДНК C. trachomatis с количеством включений на лунку микропланшета в культуральном тесте, выраженных в ВОЕ/мл (включения образующие единицы в 1 мл) показало невысокий коэффициент корреляции (r=0.63) между двумя тестами. Образцы с концентрацией ДНК C. trachomatis меньше 104ГЭ/мл были отрицательными в культуральном тесте, а образцам со значениями концентрацией ДНК C. trachomatis больше 106 ГЭ/мл имели максимальные значения ВОЕ/мл. Однако, образцы с промежуточными значениями концентраций ДНК C.trachomatis 104-105 ГЭ/мл могли быть как положительными, так и отрицательными в культуральном тесте. Достоверность наличия C. trachomatis в образцах, которые оказались отрицательными при   культуральном исследовании, была подтверждена с использованием независимого амплификационного метода НАСБА (NASBA), с помощью которого в этих образцах были обнаружены рРНК C. trachomatis [Шипицына Е.В. с соавт., 2005].

Заключение: Разработана методика на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая определять концентрацию ДНК C. trachomatis в клиническом материале. Метод культуры клеток обладает более низкой чувствительностью и не может использоваться для адекватного определения бактериальной нагрузки при хламидийной инфекции. Требуются дальнейшие исследования, направленные на стандартизацию условий получения клинического материала. 


Возврат к списку



Copyright© ООО «ИЛС» 2002-2024г. Все права защищены. Информация на сайте не является публичной офертой. Политика обработки персональных данных.
x
Наш сайт использует файлы cookie и похожие технологии для удобства пользователей. Продолжая пользоваться сайтом, Вы подтверждаете свое согласие на использование cookie.