8 (800) 100-28-84 (бесплатно для звонков по РФ)

Количественный подход в диагностике генитальной папилломавирусной инфекции

Меню
Категории

Количественный подход в диагностике генитальной папилломавирусной инфекции

Введение


Общепринятым и широко распространенным на сегодняшний день методом выявления цервикальной онкологической патологии является цитологический анализ мазка. Однако, длительный опыт его использования в России и ряде других стран мира показал, что данный метод не лишен ряда существенных недостатков. К ним могут быть отнесены в сложность исполнения, необъективность трактовки результатов, сложность стандартизации и высокие требования к квалификации врача-цитолога. В конечном итоге результатом этого становится низкая воспроизводимость (конкорданс результатов от 11% до 80%) и низкая чувствительность метода (40-60%), что не может соответствовать требованиям, предъявляемым к скрининговым тестам. Другим инструментом, который может быть задействован для выявления патологии шейки матки является расширенное кольпоскопическое исследование с прицельным взятием биопсии. Однако ряд данных свидетельствует о том, что кольпоскопическое исследование может давать до 50% ложноположительных результатов, 25% тяжелых поражений эпителия расцениваются как легкие. Ввиду этого в мире не рекомендуется использование кольпоскопии с биопсией как метода скринингового обследования. Предназначение этих методов ­– исследования второй очереди после выявления группы риска в ходе скрининга. Однако, ввиду того, что существующая на сегодняшний день схема скрининговой диагностики патологий шейки матки, основанная на цитологическом исследовании оказывается низкоэффективной, врачи прибегают к видоизменению схемы и использованию кольпоскопии параллельно или до цитологии, что, хотя и повышает чувствительность, резко снижает специфичность.

Открытие этиологической роли вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки позволило использовать молекулярные методы для улучшения схемы диагностики цервикальной дисплазии и рака. Основным свойством ВПЧ-тестирования считается принцип «отрицательный значит отрицательный». Это означает, что при отсутствии вируса онкологический процесс крайне маловероятен. На сегодняшний день рядом международных организаций (ASCCP, EUROGIN, IARC WHO) тест на ДНК ВПЧ рекомендован к использованию в следующих ситуациях 1) для проведения первичного скрининга совместно с цитологическим исследованием для женщин старше 30 лет (чувствительность скрининга повышается до 99-100%) 2) на втором этапе после цитологии, для разрешения сомнительных результатов (ASC-US). 3) Контроль проведенного хирургического лечения CIN2+ 4) на первом этапе скрининга до цитологии для стран и регионов, где плохо организованы программы цервикального цитологического скрининга.

Однако для использования в скрининге и мониторинге терапии тестирования на ДНК ВПЧ и уверенности в надежности результатов используемый тест должен удовлетворять ряду требований. Это, во-первых, выявление широкого спектра генотипов ВПЧ высокого онкогенного риска (не менее 10 наиболее распространенных), во-вторых, невыявление низкоонкогенных типов ВПЧ, снижающих специфичность исследования. Наконец в работах последних лет большое внимание уделяется вирусной нагрузке и установлению порога клинически значимого количества вируса. Показано, что выявление вируса в количестве, не превышающем пороговый уровень, имеет малое клиническое значение, так как говорит о высокой вероятности самостоятельного излечения без применения медикаментозных и хирургических средств. Считается, что для нужд скрининга и диспансеризации, когда отсутствует анамнез папилломавирусной инфекции, данный порог обязателен к использованию: учитываются как «положительные», то есть требующие дальнейшего обследования и наблюдения, только пациентки с вирусной нагрузки превышающей порог клинической значимости (Snijders, 2003). В случае использования ВПЧ-тестирования в пост-операционном мониторинге CIN2+, выявление вируса даже с низкой нагрузкой может быть ранним маркером рецидива, потому использование порога не осуществляется.

Таким образом, еще одной важной задачей ВПЧ-теста становится возможность определения вирусной нагрузки и отделения клинически значимого количества вируса от клинически незначимого.


Целью настоящей работы была разработка методики количественного определения широкого спектра генотипов ВПЧ высокого онкогенного риска (12 типов) на основе технологии ПЦР в реальном времени и оценка ее клинических характеристик в условиях скрининга.


Материалы и методы

В качестве метода для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ использовалась полимеразная цепная реакция в реальном времени. В разработанной для этих целей тест-системе «Амплисенс ВПЧ ВКР Скрин-Титр FRT», используется принцип амплификации с выщеплением 5’-концевой метки специфического зонда (TaqMan Assay) и принцип группоспецифических олигонуклеотидов, способных амплифицировать фрагменты ДНК нескольких представителей филогенетической группы. Количественное определение основано на использовании стандартных образцов с известной концентрацией ДНК ВПЧ и ДНК человека. Результат рассчитывается в логарифмах геномных эквивалентов вируса (ГЭ) нормализованных на 100 тысяч (105) геномов человека. Нормализация на количество геномов позволяет нивелировать эффект вариаций забора клинического материала. Порог релевантного количества вируса принимался равным 103 ГЭна 105 геномов человека, что примерно соответствует (при использовании предложенного нами метода взятия образцов (цервикальный цитологический зонд помещается в 500 мкл транспортной среды с муколитиком (транспортная среда «АмплиСенс»-женская, производства ФГУН ЦНИИЭ) и сохраняется до доставки в лабораторию) и метода экстракции ДНК (сорбция на частицах силикагеля, ДНК-Сорб-АМ и ДНК-Сорб-Д, ФГУН ЦНИИЭ)) порогу в 1 пг/мл ДНК ВПЧ, описанному Snijders и Lorincz как порог релевантного количества вируса. Оценка возможностей количественной оценки проведена на 99 образцах, охарактеризованных методом жидкостной цитологии и гистологии как H-SIL или РШМ и 305 образцах охарактеризованных как норма или реактивные изменения. Все образцы были получены от пациенток, проходящих обследование в центре патологии шейки матки, кафедра акушерства и гинекологии МГМСУ.


Результаты

В ходе исследования при помощи разработанной методики образцов H-SIL и РШМ ДНК ВПЧ выявлена в 99,0% случаев (98 из 99), при введении количественного порога 103 ГЭВПЧ (3lg) на 105 геномов  – в 98,0% (97 из 99). В одном образце вирусная нагрузка составила 2,9 lg, что оказалось на 0,1 ниже порогового значения. При попытке повысить пороговое значение до 104 ГЭВПЧ (4lg) на 105 геномов количество выявленных случаев H-SIL составило 84,8% (84 из 99). Таким образом, в случае тяжелой дисплазии и рака вирусная нагрузка практически никогда не оказывается ниже порога 103 ГЭВПЧ (3lg) на 105 геномов, при этом попытка повысить данный порог приводит к потере чувствительности.

При исследовании образцов нормы или реактивных изменений ДНК ВПЧ выявлена в 36,8% образцов (112 из 305) (диагностическая специфичность по отношению к выявлению дисплазии ШМ ­– 63,2%). Введение порога клинической значимости на уровне 103 ГЭ ВПЧ (3lg) на 105 геномов позволило отсечь 51% ВПЧ положительных образцов с диагнозом норма или реактивные (57 из 112) как содержащих незначимое количество вируса. Таким образом, при использовании порога клинической значимости ДНК ВПЧ в образцах нормы или с реактивными изменениями выявляется в 18,1% (55 из 305), диагностическая специфичность увеличилась на 18,7% и составила 81,9%.


Заключение

Нами была разработана методика количественного определения 12 генотипов ДНК ВПЧ на основе ПЦР в режиме реального времени и показано, что введение порога клинически значимого количества вируса на уровне 103 ГЭ на 105 геномов человека позволяет повысить специфичность исследования с 63,2% до 81,9% при сохранении чувствительности на высоком уровне – 98%. Таким образом, введение порога вирусной нагрузки может быть рекомендовано для проведения более специфичного скрининга.


Возврат к списку



Copyright© ООО «ИЛС» 2002-2024г. Все права защищены. Информация на сайте не является публичной офертой. Политика обработки персональных данных.
x
Наш сайт использует файлы cookie и похожие технологии для удобства пользователей. Продолжая пользоваться сайтом, Вы подтверждаете свое согласие на использование cookie.