Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и выполнению генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции

Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и выполнению генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции

Предисловие

1. Разработаны и внесены:

- Российским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб", исполнители: д.м.н. Куличенко А.Н., профессор, д.б.н. Ю.А. Попов;

- Российским информационно-аналитическим центром Госкомсанэпиднадзора РФ, исполнитель Опочинский Э.Ф.;

- НИИ физико-химической медицины Минздравмедпрома РФ, исполнитель к.б.н. Говорун В.М.;

- Московской станцией переливания крови, исполнитель профессор, д.м.н. Федоров Н.А.

2. Утверждены _________________ "__" ________________ 1996 г.

Дата введения - с момента утверждения.

3. Рассмотрены и рекомендованы к утверждению Межведомственным научным советом по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ (протокол N 2 от 2 ноября 1996 г.).

4. Введены впервые.

 

1. Область применения

Данный документ предназначен для санитарно-профилактических и лечебно-профилактических учреждений, применяющих метод ПЦР для обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний и генотипирования.

 

2. Обоснование необходимости

В настоящее время имеется всего два нормативных документа, регламентирующих использование ПЦР:

- "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения", утвержденные Госкомсанэпиднадзором 22.06.95;

- информационное письмо Минздравмедпрома "Применение метода полимеразной цепной реакции для выявления хламидийной, микоплазменной и уреаплазменной инфекции в акушерско-гинекологической практике" (1995 г.).

Методика исследования частично представлена во втором документе, который, как видно из его названия, имеет узкую направленность. Кроме того, до настоящего времени не были регламентированы способы подготовки тестируемого материала, а также методы исследования пищевых продуктов.

Настоящий документ утверждает основные методические приемы постановки ПЦР, лежащей в основе современных модификаций генетических способов детекции необразующих споры микроорганизмов в клиническом материале (крови, моче, мокроте, экссудате, фекалиях, соскобов со слизистых), в твердых и жидких пищевых продуктах, воде, смывах с объектов, почве, а также при генотипировании различной ДНК (людей, животных, микроорганизмов) и обнаружении аномалий ДНК.

 

3. Принцип метода

В основе ПЦР лежит амплификация (умножение) участка генома путем многократного копирования специфичной для данного организма нуклеотидной последовательности. Реакция осуществляется при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы (Таq-полимеразы) и комплементарных ДНК-мишени олигонуклеотидных праймеров. Образование в результате реакции фрагментов ДНК определенного размера оценивается как факт, свидетельствующий о наличии в пробе клеток искомого микроба, или позволяет идентифицировать исследуемую ДНК.

 

4. Общие требования

(См. также "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения", утвержденные ГКСЭН 22.06.95.)

В связи с высокой чувствительностью ПЦР может возникать серьезная техническая проблема - возможность контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств "положительной" ДНК (специфических продуктов амплификации, положительного контроля, "положительной" ДНК из образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфичного фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложно-положительных результатов. Поэтому при выполнении методик должны быть выполнены следующие требования:

4.1. Разделение лаборатории на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-анализа, в том числе для:

- обработки клинических образцов и выделения ДНК;

- приготовления реакционной смеси для ПЦР и постановки ПЦР;

- детекции продуктов амплификации; эта комната по возможности должна быть расположена как можно дальше от остальных помещений. Целесообразно отдельные этапы работы проводить в ламинарном шкафу (шкафах) двойной защиты: оператора и рабочей зоны.

4.2. Каждое из названных выше помещений ПЦР-генодиагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в нем.

4.3. Одноразовые пробирки и наконечники для автоматических пипеток использовать однократно. Необходимо обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

4.4. Следует исключить проведение в ПЦР-генодиагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности амплифицированных в ПЦР ДНК-матриц.

4.5. Приготовление реактивов должно производиться в отдельной чистой комнате. Все растворы должны храниться и использоваться в виде небольших порций (аликвот).

4.6. Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки, другие материалы, загрязненные ДНК, необходимо обрабатывать реагентами, вызывающими деградацию ДНК, например 0,3 N соляной кислотой.

4.7. При постановке ПЦР следует готовить смесь реактивов для ПЦР, расчитанную на все пробы, включая контрольные, и затем - раскапывать ее по пробиркам.

4.8. Во всех случаях постановки ПЦР следует обязательно применять отрицательные и положительные контроли.

4.9. Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом минимум в течение 3 часов.

4.10. Анализ продуктов ПЦР должен выполняться сотрудниками лаборатории, не производящими обработки тестируемых образцов и раскапывания реакционной смеси.

 

5. Оборудование, реактивы и материалы, необходимые для постановки реакции (могут использоваться аналоги указанного оборудования, реактивов и материалов других фирм и стран; основные реактивы и материалы входят в коммерческие наборы для постановки ПЦР)

5.1. Средства измерения:

5.1.1. Весы лабораторные 2 класса (максимальная нагрузка до 200 г, основная погрешность при измерении не более 0,2 мг); используются для взвешивания сухих ингредиентов при подготовке рабочих растворов;

5.1.2. Иономер (рН-метр); используется для определения рН буферных растворов;

5.2. Оборудование:

5.2.1. Программируемый термоциклер (амплификатор); Amply 250 Биоком, Россия;

5.2.2. Источник постоянного тока, Биоком, Россия;

5.2.3. Дистиллятор ДЭ-4-2, завод медоборудования, г. Саранск;

5.2.4. Бидистиллятор АСД-4, Россия;

5.2.5. Аппарат для встряхивания - вортекс;

5.2.6. Шкаф сушильный ШСС-80П, з-д медаппаратуры, Казань;

5.2.7. Центрифуга лабораторная "Eppendorf", Германия;

5.2.8. Термостат ТС-80М-2 диапазон рабочих температур 28 - 55 °С, ПО "Медлабортехника", г. Одесса, Украина;

5.2.9. Холодильник - морозильная камера (до минус 25 °С), Саратов;

5.2.10. Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру 3 - 5 град. С, "Atlant", Беларусь;

5.2.11. Центрифуга "Beckman" J2-21, США;

5.2.12. Баня водяная с электрическим подогревом, ГСП-2, з-д РЭМА, г. Львов, Украина;

5.2.13. Аппарат для электрофореза ПГ-9, размеры камеры 9 х 13 см, Беларусь;

5.2.14. Ультрафиолетовый трансиллюминатор "ФЛУСКОН" "Диа-М", Россия;

5.2.15. Автоклав ВК-16, Россия;

5.2.16. Ламинарный шкаф, фирма "Интермедикал", Беларусь;

5.2.17. Настенные, потолочные или передвижные источники ультрафиолетового света.

5.3. Вспомогательные изделия и материалы:

5.3.1. Вата медицинская, ГОСТ 5556-81;

5.3.2. Микроцентрифужные пробирки-виалы "Alpha", Англия, 0,5 - 1,5 мл;

5.3.3. Колбы мерные, ГОСТ 12738-77, 50, 100, 200, 500, 1000 мл;

5.3.4. Лабораторный штатив, ТУ 64-17-07-72;

5.3.5. Микродозаторы "Ленпипет", Россия, 1 - 20, 20 - 200, 200 - 1000 мкл;

5.3.6. Наконечники для микродозаторов "Ленпипет", Россия;

5.3.7. Пробирки, ГОСТ 10-515-75;

5.3.8. Пипетка мерная, ГОСТ 20292-74;

5.3.9. Фотопленка "Тасма", Россия, "Микрат-300";

5.3.10. Фотобачок 350 мл;

5.3.11. Цилиндр мерный ГОСТ 1770-74, 1 - 25, 1 - 100, 1 - 1000 мл;

5.4. Реактивы, растворы:

5.4.1. Агароза "Sigma", США (тип 11);

5.4.2. Вода бидистиллированная;

5.4.3. Масло вазелиновое, ГОСТ 3161-78 (хч);

5.4.4. Магния хлорид, ГОСТ 4165-78 (хч);

5.4.5. Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77 (хч);

5.4.6. Натрия додецилсульфат "Serva", ФРГ;

5.4.7. Спирт этиловый, ГОСТ 18300-87 (ректификат);

5.4.8. Спирт изоамиловый, ГОСТ 5830-79;

5.4.9. Натрия гидроокись, ГОСТ 4328-77;

5.4.10. Фенол (Реахим);

5.4.11. Хлороформ, ГОСТ 1248-72;

5.4.12. тРНК "Serva", Германия;

5.4.13. Трис-(оксиметил)-аминометан, ТУ 6-09-4292-76;

5.4.14. ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), ГОСТ 10652-73;

5.4.15. Этидий бромистый "Serva", Германия;

5.4.16. Бромфеноловый синий "Serva", Германия;

5.4.17. Тритон Х-100 "Serva", Германия;

5.4.18. Протеиназа К "Serva", Германия;

5.4.19. Соляная кислота, хч, ГОСТ 3118-67;

5.4.20. Мертиолят натрия "Serva", Германия;

5.4.21. Ацетон, хч, "Хема", Словения;

5.4.22. Бычий сывороточный альбумин (БСА) НПФ "Биотех";

5.4.23. 2-меркаптоэтанол "Serva", Германия;

5.4.24. Набор дезоксинуклеотидтрифосфатов НПО "Вектор", Россия;

5.4.25. Специфичные праймеры для амплификации ДНК конкретных видов искомых микроорганизмов, НПО "Биомастер", "Ниармедик Лтд", НПФ "Литех", Россия;

5.4.26. Образцы ДНК конкретных микроорганизмов (в качестве положительных контролей); "Ниармедик Лтд", РосНИПЧИ "Микроб", Россия;

5.4.27. Фермент термостабильной ДНК-полимеразы НПО "Биомастер", Россия, выделяемый из штамма микроорганизма Thermus aquaticus УТ-1;

5.4.28. Гуанидинтиоционат "Serva", Германия, или фирма "Экрос", Санкт-Петербург;

5.4.29. Двуокись кремния (SiO ) с размером частиц 0,5 - 10 2 2 микрон "Sigma", США.

 

5. Методы отбора и подготовки проб

Только пробы воды могут исследоваться в ПЦР без предварительной процедуры подготовки исследуемого материала (лизис кипячением). При анализе других объектов необходим этап лизиса клеток и очистки ДНК от веществ, ингибирующих ПЦР. Наиболее универсальным является метод подготовки проб, основанный на щелочном лизисе клеток с последующей фенол-хлороформовой экстракцией и очисткой ДНК преципитацией этанолом, однако применение его для исследования большого числа проб требует значительных затрат времени, имеется риск перекрестной контаминации, потери ДНК. В связи с этим в последнее время для подготовки проб используют метод экстракции ДНК путем лизиса микробных клеток в 6 М гуанидинтиоционате с последующей сорбцией ДНК на частицах двуокиси кремния определенной степени измельчения.

5.1. Взятие материала для исследования.

Забор образцов необходимо производить только в одноразовые пластиковые микроцентрифужные пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщательно промытые и прокаленные.

При работе с кровью к образцу объемом 0,5 - 1 мл немедленно после забора добавляют 1/10 объема 4% раствора цитрата натрия. Осторожно перемешивают.

При анализе биологических жидкостей (экссудат, моча, мокрота), водных смывов, жидких пищевых продуктов (молоко, соки и т.д.) с лизирующим буфером смешивают 50 - 200 мкл образца.

Твердые пищевые продукты (мясо, овощи и т.д.) в количестве 1 г растирают в ступке с 0,5 - 1,0 г стеклянного порошка (двуокиси кремния), добавляют 2 - 4 мл бидистиллированной воды, центрифугируют при 2000 об./мин. в течение 2 - 3 мин. Один миллилитр супернатанта переносят в микроцентрифужные пробирки, центрифугируют при 12000 об./мин. в течение 10 мин. Осадок суспендируют в лизирующем буфере.

Почву в количестве 1,0 - 1,5 г тщательно перемешивают на вортексе с 2 мл бидистиллированной воды, отстаивают в течение 10 мин. для оседания крупных частиц. Один миллилитр надосадочной жидкости переносят в микроцентрифужные пробирки, центрифугируют при 12000 об./мин. в течение 10 мин. Осадок суспендируют в лизирующем буфере.

Исследуемые пробы воды в количестве 5 - 10 мл центрифугируют при 8000 об./мин. в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 50 мкл бидистиллированной воды, переносят в микроцентрифужные пробирки и помещают их в кипящую водяную баню на 3 - 5 мин., центрифугируют при 12000 об./мин. в течение 2 - 3 мин. Супернатант тестируют в ПЦР.

5.2. Обеззараживание исследуемого материала.

При работе с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность микроорганизмами I - II групп патогенности, пробы обеззараживают путем добавления мертиолята натрия (контроль качества мертиолята натрия, см. "Рук-во по профилактике чумы", Саратов, 1992) до конечной концентрации 0,01% с прогреванием при 56 °С в течение 30 - 40 мин. (Санитарные правила 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности").

5.3. Выделение очищенной ДНК методом фенол-хлороформовой экстракции.

5.3.1. Подготовка реактивов для лизиса клеток и очистки ДНК-матриц

Лизирующий буфер

Делают навески: Трис-(оксиметил)-аминометан - 0,024 г (0,2 м), натрия додецилсульфат - 5,0 г (5%), натрия гидроокись - 0,0016 г (0,04 м). Доводят дистиллированной водой до 200 мл.

Фенол-хлороформовая смесь.

В герметично закрывающемся мерном цилиндре смешивают: 25 мл фенола (рН 7,0), 24 мл хлороформа, 1 мл изоамилового спирта.

Раствор тРНК.

Делают навеску тРНК = 5 мг, растворяют в 1 мл бидиотиллированной воды, хранят при -20 °С.

5.3.2. Лизис клеток и выделение очищенной ДНК

200 мкл исследуемого образца смешивают с 200 мкл лизирующего буфера и инкубируют в течение 15 - 20 мин. при 37 - 42 °С. ДНК экстрагируют, добавляя в пробирку 400 мкл фенол-хлороформовой смеси, тщательно перемешивают. Центрифугируют при 12000 об./мин. в течение 2 - 5 мин. Отбирают 200 - 300 мкл водной фазы. К полученному супернатанту добавляют 1/10 объема раствора т-РНК (5 мкг/мкл), натрия ацетат - 3 М - 1/10 объема и два объема охлажденного этанола. Выдерживают 15 мин. при -70 °С (или 2 часа при -20 °С) и затем центрифугируют при 12000 об./мин. 10 мин. Осадок растворяют в 25 мкл стерильной бидистиллированной воды и используют для проведения ПЦР.

5.4. Выделение ДНК методом нуклеосорбции.

5.4.1. Приготовление рабочих растворов

Лизирующий буфер (ЛБ)

Гуанидинтиоционат (конечная концентрация 6 М) 18 г; дитиотрейтол (0,2 М) 95 мг; ЭДТА (0,5 М) 1 мг - все компоненты растворяют в 30 мл дистиллированной воды.

Раствор для первой отмывки (ОР-1)

Гуанидинтиоционат (4 М) 12 г, дитиотрейтол (0,2 М) 95 мг - растворяют в 30 мл дистиллированной воды.

Раствор для второй отмывки (ОР-2)

Трис-(оксиметил)-аминометан (1 М, рН 7,3) 1 мл; натрия хлорид (5 М) 1 мл; этанол (50%) 50 мл; дистиллированной воды 50 мл.

Суспензия сорбента (СС)
Готовят 50% (вес/объем) суспензию силикагеля (SiO ) в 2-деионизированной воде.

5.4.2. Методика выделения ДНК.

1. В пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл вносят по 900 мкл ЛБ и 40 мкл СС, встряхивают на вортексе в случае немедленного использования или сохраняют до 1 недели.

2. Вносят 50 мкл исследуемого материала, подготовленного как указано выше, немедленно встряхивают на вортексе в течение 5 секунд, оставляют на 10 минут при комнатной температуре, повторно встряхивают в течение 5 секунд и центрифугируют в течение 15 секунд в микроцентрифуге типа "эппендорф" (угловой ротор 12000 g). Супернатант удаляют в сосуд с 10 М раствором NaOH, не допуская разбавления щелочи ниже 0,3 М. Таким образом достигается нейтрализация ядовитой синильной кислоты - HCN, которую может образовывать ГТЦ при контакте с кислотами.

3. Осадок сорбента отмывают 2 раза в ОБ, затем дважды 70% этанолом, 1 раз ацетоном.

4. После удаления ацетона пробирки с открытыми крышками прогревают в микротермостате при 56 °С в течение 10 минут.

5. К осадку сорбента добавляют 50 - 75 мкл ЭБ. При экстракции РНК желательно добавлять также ингибитор РНК-полимераз. Пробирки закрывают крышками, встряхивают на вортексе в течение нескольких секунд, инкубируют 10 минут при 56 °С, повторно встряхивают и центрифугируют 2 минуты при 12000 g. Супернатант содержит ДНК и РНК и используется для постановки ПЦР.

 

6. Проведение ПЦР

6.1. Приготовление реакционной смеси для ПЦР.

В микроцентрифужные пробирки емкостью 0,5 мл последовательно, с помощью автоматической микропипетки, добавляют: 10-кратный буферный раствор (трис-НС), рН 8,4 - 670 мМ; хлорид магнтия - 25 мМ; 2-меркаптоэтанол - 100 мМ; сульфат аммония - 166 мМ) - 5 мкл; раствор бычьего сывороточного альбумина (1,7 мг/мл) - 2 мкл; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (из смеси дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ по 0,2 мМ каждого) - 5 мкл; раствор каждого праймера - по 2 мкл (12 - 50 пМ); образец (лизат клеток) - 25 мкл. Общий объем реакционной смеси доводят до 48 мкл бидистиллированной водой. Рекомендуется готовить общую смесь реактивов в количестве, соответствующем числу проб, добавляя вышеназванные ингредиенты в указанных пропорциях.

В одну из пробирок (положительный контроль) вместо образца вносят контрольный препарат ДНК - 1 мкл (0,1 нМ), 10х буфер, растворы дезоксинуклеотидтрифосфатов, БСА и праймеров - в тех же количествах, что и с образцом. Общий объем реакционной смеси доводят до 48 мкл бидистиллированной водой. При использовании ПЦР для детекции ДНК-матриц в качестве положительного контроля возможно использование лизата клеток искомого организма. Для отрицательного контроля вместо образца вносят 25 мкл бидистиллированной воды, остальные ингредиенты в тех же количествах. На поверхность реакционной смеси наслаивают по 30 мкл стерильного вазелинового масла.

Возможна иная компоновка реакционной смеси в соответствии с утвержденными инструкциями по применению используемых тест-наборов.

Пробирки помещают в термоциклер и денатурируют содержимое нагреванием при температуре 94 °С в течение 10 минут. Не допуская охлаждения, в каждую пробирку добавляют по 2 мкл (1 - 2,5 ед.) Таq-полимеразы (или другой термостабильной ДНК-полимеразы).

Проводят реакцию амплификации. Каждый цикл амплификации включает в себя три температурных режима: денатурацию ДНК (92 - 94 °С - 1 мин.), отжиг праймеров (45 - 68 °С - 0,5 - 2 мин.), синтез комплементарной цепи (70 - 72 °С - 1 - 3 мин.). Параметры и число циклов амплификации должны соответствовать инструкциям по применению наборов (или другим методическим документам).

После последнего цикла пробы прогревают в течение 10 мин. при температуре 72 °С (при необходимости оставить пробы после реакции на ночь, их помещают в холодильник на 4 °С или вводят дополнительный цикл на амплификаторе: 4 °С - 12 ч или более).

 

7. Учет результатов ПЦР методом гель-электрофореза

7.1. Подготовка к электрофорезу в агарозном геле.

Приготовление буферного раствора для электрофореза (ЭБ). В мерном цилиндре смешивают: трис - 4,84 г, ледяная уксусная кислота - 1,2 мл, ЭДТА из раствора 0,5 М - 100 мл, общий объем доводят дистиллированной водой до 1 л. Бромистый этидий добавляют до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Приготовление буфера для нанесения образцов (БО). В 100 мл дистиллированной воды вносят бромфеноловый синий - 0,25 г, фикол - 15 г.

Приготовление 2% агарозного геля. К 1,0 г агарозы добавляют 50 мл буферного раствора для электрофореза. Смесь в термостойкой колбе нагревают в кипящей водяной бане, пока агароза не расплавится, после охлаждения агарозы до температуры 50 °С - выливают на подготовленный столик аппарата для электрофореза (типа ПГ-9), при этом образуется слой агарозы высотой 4 мм. С помощью специального штампа - "гребенки" на катодном конце геля формируют лунки для нанесения проб. Между дном лунок и основанием геля должен оставаться слой агарозы 0,5 - 1,0 мм.

Буферные емкости аппарата ПГ-9 заполняют ЭБ, при этом он должен покрывать гель слоем 4 - 5 мм. При необходимости разделения фрагментов ДНК, отличающихся на 20 - 50 пн, используют 2,5 - 3% агарозный гель.

7.2. Проведение электрофореза

По окончании ПЦР к 15 - 20 мкл реакционной смеси добавляют 1 - 2 мкл 10х буфера БО. Смеси вносят в лунки геля под буферный раствор для электрофореза с помощью микродозатора.

Электрофорез проводят при градиенте напряжения 10 В/см в течение 45 - 90 мин., пока краситель - бромфеноловый синий - не пройдет от катодного конца геля 6 - 8 см (для разделения фрагментов ДНК, отличающихся на 20 - 50 пн, - 10 - 20 см).

Окрашенную бромистым этидием ДНК в геле просматривают под ультрафиолетовым излучением, для чего используют трансиллюминатор с максимальной длиной волны 254 нм. Гель фотографируют в проходящем ультрафиолете на фотопленку "Микрат-300", которую проявляют обычным способом.

При использовании ПЦР для детекции микроорганизмов результаты оценивают по наличию в геле фрагментов ДНК, полоски которых располагаются на том же уровне, что и в положительном контроле (имеют аналогичные размеры). В отрицательном контроле ПЦР-продукты отсутствуют.