Мониторинг лечения инфекции, вызванной Mycoplasma genitalium с помощью методов ПЦР в количественном формате и НАСБА с детекцией в реальном времени

Мониторинг лечения инфекции, вызванной Mycoplasma genitalium с помощью методов ПЦР в количественном формате и НАСБА с детекцией в реальном времени

Введение

Mycoplasma genitalium – микроорганизм, который впервые был выделен от мужчин с негонококковым (НГУ) и нехламидийным уретритом (НХУ) Tully JG и Taylor-Robinson D в 1980 г. На данный момент M. genitalium – самый мелкий из известных в природе свободно живущих микроорганизмов, размер его генома составляет 580 тыс.п. осн. является паразитом человека, колонизирующим слизистые оболочки уроганитального тракта и вызывающим развитие воспалительных процессов. В настоящее время M.genitalium рассматривается, как безусловно-патогенный микроорганизм, являющийся самостоятельным этиологическим агентом воспалительных заболеваний органов репродукции человека. В нескольких независимых исследованиях было показано, что M.genitalium вызывает слизисто-гнойный цервицит в отсутствие N.gonorrhoeae и C.trachomatis [Uno M., 1997, Manhart LE, 2003, Falk L, 2005, Pepin J, 2005]. При этом, клинические проявления цервицита, вызванного M.genitalium практически не отличаются от цервицита хламидийной этиологии [Falk L, 2005]. Кроме того, было показана связь M.genitalium с воспалительными заболеваниями верхних отделов органов репродукции женщин. В модельных экспериментах на обезьянах была показана способность M.genitalium вызывать сальпингит [Moller BR., 1985], а позднее M.genitalium была обнаружена в биописийном материале трубного эпителия при остром сальпингите у женщин [Cohen CR, 2005]. Несколько ранее было показано, что инфицирование M.genitalium слизистой эндометрия сопровождается клинической и морфологической картиной острого эндометрита [Cohen CR, 2002]. Прямая связь M.genitalium с ВЗОМТ также была показана в работе [Simms I, 2003].

У мужчин M.genitalium является этиологическим агентом острого и хронического уретрита [Horner P., 2001], при этом в отличие от уреаплазм практически не встречается у здоровых людей. Более того, уретрит, вызванный M.genitalium протекает в манифестной форме чаще, чем хламидийный уретрит [Falk L., 2005]. По данным разных авторов доля уретритов, вызванных M.genitalium, составляет от 10 до 25%.

Диагностика M.genitalium невозможна с использованием методов, традиционно применяемых для выявления других возбудителей ИППП – микроскопии, в следствие чрезвычайно малых размеров возбудителя; бактериологического посева, вследствие низкой скорости деления клеток микоплазм и высоких требований к составу сред;  ИФА в следствие того, что M.genitalium обладает низкими иммуногенными свойствами, а кроме того несет родовые антигены, встречающиеся у других представителей молликут, колонизирующих человеческий организм. В связи с этим единственными доступными методами  лабораторной диагностики инфекции, вызванной M.genitalium являются методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Наиболее широко применяются  тесты на основе ПЦР в реальном времени, позволяющие   определять не только возбудитель, но и его концентрацию в клиническом материале [Jensen J., 2002]. Помимо этого был описан тест на основе реакции транскрипционной амплификации ТМА (Gene-Probe Inc, США). Благодаря использованию в качестве мишени многокопийных РНК-мишеней чувствительность ТМА по сравнению с ПЦР оказалась выше [Hardick J., 2006]. 

Целью настоящего исследования явилось изучение использования ПЦР в реальном времени в количественном формате и НАСБА в реальном времени при мониторинге терапии мужчин с негонококковым уретритом, вызванным M.genitalium.

Материалы и методы

Было обследован 241 мужчина, посетившие клиники дермато-венерологического профиля с жалобами и клиническими проявлениями уретрита. От каждого пациента были получены мазки из уретры, для микроскопического исследования с окраской по Граму и мазки для исследования методом ПЦР на возбудители ИППП (C.trachomatis, N.gonorrhoeae, T.vaginalis, HSV1/2), включая M.genitalium. В данное исследование были включены пациенты с положительными результатами ПЦР на M.genitalium и отрицательными результатами на другие ИППП,    давшие информированное согласие.  Пациентам было назначено лечение препаратом джозамицин (Вильпрафен, «Астеллас Фарма»), в дозировке 500 мг х 3раза в день, 10 дней. Мониторинг лечения  включал проведение микроскопического исследования мазка, количественного исследования ДНК и качественного исследования РНК M.genitalium в  мазке и первой порции мочи (ППМ) в 1-й день терапии (Д0, до начала приема антибиотика), на 3-й день (Д3) и на 8-й день (Д8) лечения Вильпрафеном. Кроме того были проведены два контроля лечения  указанными методами  на 2-й (Д2 п/л) и на 38 (Д38 п/л) дни после окончания терапии.

Результаты

На этапе скрининга методом ПЦР ДНК M.genitalium была обнаружена в мазках из уретры у 24 пациентов (11%), из них 13 дали согласие и были включены в исследование. У всех пациентов были жалобы на дизурию, при этом у 10 (77%) наблюдались выделения – у 3 (23%) слизистые, у 5 (38) слизисто-гнойные и у 2 гнойные. При микроскопии мазка из уретры повышенное содержание лейкоцитов (более 10 в поле зрения) являющееся лабораторным признаком уретрита, было обнаружено у всех пациентов, при этом у 4 (30%) пациентов воспалительная картина сопровождалась высоким лейкоцитозом (все поле зрения), характерным больше для гонококковой инфекции.

Исследование мазка из уретры и ППМ до начала терапии методами ПЦР в количественном формате и НАСБА в реальном времени у всех пациентов выявило ДНК и РНК как в уретральном мазке, так и в ППМ. Концентрация ДНК M.genitalium в соскобном материале варьировала от 10⁴ до 10⁶   ГЭ/мл, и в моче  - от 10³ до 10 ⁵ ГЭ/мл (Рисунки 1 и 2, концентрация ДНК M.genitalium выражена в lg ГЭ/мл, от 0 до 7).   

Рисунок 1. Динамика элиминации ДНК M.genitalium  в соскобе из уретры в процессе лечения Вильпрафеном (Пациенты Р1-Р13).

 

Рисунок 2. Динамика элиминации ДНК M.genitalium в ППМ в процессе лечения Вильпрафеном (Пациенты Р1-Р13).

В процессе терапии на 3-й день лечения концентрация ДНК M.genitalium снизилась до недетектируемого уровня у 6 пациентов, в то время как у 3-х из них в ППМ ДНК еще обнаруживалась. К 8-му дню терапии ДНК M.genitalium обнаруживалась у 2-х пациентов в соскобе уретры и у 3-х ППМ. Наконец, на 2-й день после окончания лечения только у 1 пациента обнаруживалась ДНК в соскобе уретры и ППМ. На 13-й день после окончания терапии у данного пациента наблюдался рост концентрации ДНК M.genitalium в моче и соскобе уретры, сопровождающийся рецидивом клинических проявлений уретрита. Исследование динамики элиминации РНК M.genitalium показало, что у всех пациентов с положительными результатами на ДНК M.genitalium результаты РНК были также положительны как в соскобе уретры, так и в ППМ. Кроме того у одного пациента (не считая пациента с рецидивом инфекции) на 13 день после окончания терапии РНК продолжала определяться в ППМ, в то время как ДНК к этому сроку уже не определялась.

Заключение.

В результате проведенного исследования клинический и микробиологический ответ при лечении джозамицином (Вильпрафеном) был получен у 12 из 13 (92%) пациентов, что оказалось выше, чем при использовании других макролидов (азитромицина) и препаратов тетрациклинового ряда  [Gambini D., 2000; Falk L., 2005; Jensen J. 2006]. У большинства пациентов ДНК и РНК M.genitalium уже не определялись  до окончания терапии джозамицином. Элиминация нуклеиновых кислот возбудителя в первой порции мочи происходила позже по сравнению с материалом из уретры, при этом элиминация ДНК происходила раньше, чем элиминация РНК. Таким образом, методы ПЦР в реальном времени в количественном формате и НАСБА в реальном времени являются эффективными инструментами изучения инфекции, вызванной M.genitalium.