Определение концентрации ДНК Neisseria gonorrhoeae с помощью количественной ПЦР «в рельном времени» в клинических образцах пациентов, обследованных на гонококковую инфекцию

Определение концентрации ДНК Neisseria gonorrhoeae с помощью количественной ПЦР «в рельном времени» в клинических образцах пациентов, обследованных на гонококковую инфекцию

Введение.

В Российской Федерации регламентированными методами диагностики гонококковой инфекции являются микроскопия (МС) окрашенного по Граму препарата   и бактериологический посев (БП), однако многочисленные зарубежные исследования показали, что диагностическая чувствительность (ДЧ) указанных методов уступает современным молекулярно-биологическим тестам,  основанным на методах амплификации нуклеиновых кислот (МАНК).    Высокую ДЧ МАНК связывают с более высокой аналитической чувствительностью, позволяющей обнаруживать генетический материал единичных клеток возбудителя. Появление метода ПЦР с детекцией флуоресцентного сигнала в реальном времени (ПЦР «в реальном времени») позволяет определить концентрацию ДНК возбудителя в клиническом образце, которая отражает бактериальную нагрузку в очаге воспаления.

Целью настоящего исследования явилось определение концентрации ДНК N.gonorrhoeae в клинических образцах пациентов, обследованных на гонококковую инфекцию регламентированными методами – МС и БП, а также    методом ПЦР в качественном формате. 

Материалы и методы:

Было обследовано 156 мужчин и 213 женщин обратившихся в КВД. Получение клинических образцов,  процедуры МС и БП, а также  исследования методом ПЦР в качественном формате описаны в работах [Сехин С.В. дисс. канд. мед. наук, Вознесенский Д.Л., дисс. канд. мед. наук].  Клинические образцы исследованные методом ПЦР в качественном формате были повторно исследованы методом ПЦР  «в реальном времени» в количественном формате. Разработка методики для определения концентрации ДНК N.gonorrhoeae в клиническом материале с помощью ПЦР «в реальном времени» нами была подробно описана в сборнике трудов 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» 2004.

Результаты:

Результаты полученные как зарубежными, так  и отечественными исследователями свидетельствуют том, что ДЧ регламентированных методов ниже, чем МАНК и  прежде всего при диагностике гонококковой инфекции у женщин (Таблица 1).

 

Таблица 1.

Метод исследования	ДЧ % Сехин С.В., Вознесенский Д.Л.		ДЧ % Ching S., 1995; Mandell G., 2005
	Муж. N=156	Жен. N=213	Муж. N=808	Жен. N=1539
Микроскопия	92.6	36.6	95	<50
Бак. посев	97.9	87.4	96.5	83.9
МАНК	99.8	99.7	97.3	98.5

 

У мужчин регламентированные методы не намного уступают МАНК, и в большинстве случаев гонорея диагностируется с помощью МС. У женщин значительное  число случаев инфекции остается не распознанным при микроскопическом исследовании, и даже при БП встречается не менее 15% ложно-отрицательных результатов.  Результаты количественного исследования показали, что не менее чем у  20% женщин концентрация ДНК N.gonorrhoeae  в клиническом материале составляла менее 5 lg геномных эквивалентов в 1 мл (ГЭ/мл), в то время как количество мужчин с такой бактериальной нагрузкой было чуть более 3%. (Рисунок 1).  Среднее значение концентрации ДНК N.gonorrhoeae  у мужчин было составило 6.3 lg ГЭ/мл, а у женщин -   5.76 lg ГЭ/мл.

 

Рисунок 1.

 

Возможно, одной из причин более низкой ДЧ регламентированных методов является более низкая бактериальная нагрузка при гонорее у ряда пациентов.  Однако низкая бактериальная нагрузка, по-видимому, не единственная причина снижения  ДЧ. Анализ 6–ти образцов, полученных от мужчин с отрицательным результатом МС, но положительным БП показал, что концентрация ДНК гонококка в этих образцах составляет в среднем 6.3 ±0.5 lg ГЭ/мл, т.е. находится в тех же пределах, что и  у пациентов с положительным результатом МС. У женщин с гонококковой инфекцией подтвержденной БП и отрицательными результатами МС среднее значение концентрации ДНК N.gonorrhoeae также составило 6.3 ±1 lg ГЭ/мл, что даже несколько выше, чем среднее значение во всей группе женщин с гонореей. Поскольку при микроскопическом исследовании препаратов, окрашенных по Граму, диагностическим критерием гонококковой  инфекции являются Грам-отрицательные диплококки, расположенные внутриклеточно, то отсутствие этого признака затрудняет постановку диагноза и снижает ДЧ метода несмотря на высокий уровень бактериальной нагрузки N.gonorrhoeae.

Анализ бактериальной нагрузки в 9-ти образцах женщин,  отрицательных обоими регламентированными методами – МС и БП, т.е. по формальным признакам не имеющих гонококковой инфекции, показал, что в 6-ти образцах концентрация ДНК гонококка составляла более 7 lg ГЭ/мл, и только у трех пациенток – менее 4 lg ГЭ/мл.    Полученные результаты кажутся на первый взгляд парадоксальными, однако следует учесть, что существует множество факторов, начиная от качества искусственных питательных сред и заканчивая наличием сопутствующей флоры, угнетающей рост и развитие культуры в искусственных условиях [Kraus S.J.,1976, Saigh J. H. 1978, Amant D., 2002], что в конечном счете, может приводить к ложно-отрицательным результатам БП .

Заключение.

Проведенное исследование с помощью разработанного количественного метода  на основе ПЦР «в реальном времени» показало, что у части пациентов, в первую очередь женщин, с отрицательными результатами регламентированных методов - МС и БП, т.е с не установленным диагнозом гонококковой инфекции, может определяться высокая концентрация ДНК N.gonorrhoeae, отражающая  высокую бактериальную нагрузку. Данный факт может иметь высокое клиническое и эпидемиологическое значение, поскольку отсутствие установленного диагноза гонореи и своевременной этиотропной терапии может способствовать дальнейшему распространению инфекции, хронизации инфекционного процесса и развитию осложнений.