Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности.

Меню

Категории

Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности.

3. Общие положения

3.1. Процесс амплификации основан на многократном увеличении числа копий фрагмента нуклеиновых кислот (ДНК/(кДНК)/РНК) или усилении сигнала в условиях in vitro, что позволяет обнаружить специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации.

3.2. Методы амплификации нуклеиновых кислот: полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР), амплификация с удалением (вытеснением) цепи (SDA), транскрипционно – опосредованная амплификация (TMA), реакция амплификации на основе нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), реакция изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдерживающаяся реакция репликации последовательностей (SSSR или 3SR), амплификация с использованием QB-репликазы, амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и т.д.

3.3. Методы амплификации сигнала: сигнальная амплификация или метод «разветвленной» ДНК (bDNAassay), прямой гибридизационный анализ на основе РНК/ДНК-зондов и т.д.

3.4. Разновидности полимеразной цепной реакции: с “горячим” стартом (hot-start PCR), мультиплексная (мультипраймерная), гнездовая (“вложенная”, nested PCR,), “инвертированная”, ассиметричная, метод молекулярных колоний, длинных фрагментов (Long-range PCR), с быстрой амплификацией концов кДНК (RACE-PCR), универсальная (broad-range PCR), с обратной транскрипцией
(ОТ-ПЦР, RT-PCR), иммуно-ПЦР (immuno-PCR-IPCR), в режиме “реального времени” (Real-Time PCR), анализ “по конечной точке” (End-point PCR) и т.д.

3.5. Форматы амплификации нуклеиновых кислот в режиме “реального времени”:

- с применением интеркалирующих флуоресцентных красителей;

- использование меченых флуоресцентными красителями олигонуклеотидных зондов, комплементарных участку ампликона (гибридизационно-флуоресцентная детекция), работающих по принципу: гидролиза зондов (линейно разрушаемые зонды (TaqMan), зондов с инвертированным концевым повтором (молекулярные “маячки”, molecular beacons), праймер – зондов (“скорпионы”, Scorpions), гибридизации зондов (с резонансным переносом энергии (FRET-технология)), “амплифлюр”(Amplifluor) - технологии и т.д.

3.6. Методы исследования, использующие продукты амплификации нуклеиновых кислот: секвенирование, ДНК – чипы, рестрикционный анализ.

3.7. Методы детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот:

- электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле);

- гибридизационно - ферментный;

- гибридизационо – флуоресцентный (детекция продукта в режиме “реального времени” или регистрация продукта после окончания реакции амплификации (“анализ по конечной точке”)).

3.8. Форматы исследования: качественный, количественный.

3.9. Основные характеристики наборов реагентов, используемых для проведения амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов I - IV групп патогенности: аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, воспроизводимость.

3.10. Методы амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов I - IV групп патогенности используют:

- как метод экспресс-диагностики при исследовании биологического материала, взятого от человека с целью выявления у него ДНК (РНК) микроорганизмов I - IV групп патогенности и их количественной оценки;

- как метод специфической индикации патогенных биологических агентов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах;

- как ускоренный предварительный тест при выполнении культурального и биологического методов исследования и для идентификации культур;

- для определения эпидемиологической значимости изолятов на основании выявления генетических маркеров вирулентности и патогенности, антибиотикоустойчивости;

- для таксономической характеристики штаммов на основании выявления специфических видовых, родовых и других маркеров;

- для генотипирования штаммов с целью определения их происхождения;

- для прогнозирования течения инфекционного заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.

3.11. По результатам анализа выдают ответ о наличии (качественный или количественный анализ) в пробе специфических фрагментов ДНК или РНК, имеющих гомологию с определенным участком генома возбудителя инфекционного заболевания, а также о наличии в исследуемом материале генетических маркеров или генетически модифицированных ДНК.

Возврат к списку