Оценка количественных методов выявления Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mobiluncus sp., основанных на ПЦР в режиме реального времени для диагностики дизбиоза влагалища

Оценка количественных методов выявления Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mobiluncus sp., основанных на ПЦР в режиме реального времени для диагностики дизбиоза влагалища

Введение: С середины 80-ых гг. в акушерско-гинекологической практике дизбиоз урогенитальнеого тракта у женщин выделен как самостоятельное заболевание – бактериальный вагиноз. Клиническая значимость бактериального вагиноза за последние десятилетие значительно увеличилась. Частота встречаемости бактериального вагиноза (БВ) в амбулаторной гинекологической практике составляет 15–19%, среди беременных женщин - 10–30%, а среди женщин с ИППП – от 30 до 70%. У каждой второй женщины это заболевание протекает бессимптомно, в связи с чем определить истинную частоту встречаемости БВ не представляется возможным.

Бактериальный вагиноз является одним из важнейших факторов, способствующих развитию воспалительных заболеваний органов малого таза, а также увеличивают риск осложнений беременности.

Более 50% случаев БВ протекают со слабовыраженной клинической картиной или при отсутствии каких-либо жалоб и клинических проявлений. Кроме того, для бактериального вагиноза остаётся открытой проблема эффективности лечения - рецидив заболевания возникает у 57% женщин через 6 месяцев после проводимого лечения, в связи с этим являются важными своевременная диагностика и мониторинг лечения бактериального вагиноза.

Патогенез бактериального вагиноза рассматривают в рамках снижения концентрации лактофлоры вследствие различных нарушений, в результате этого происходит создание благоприятных условий для размножения условно-патогенных анаэробных микроорганизмов

В настоящее время диагностика бактериального вагиноза основывается на результатах микроскопического исследования вагинального мазка и/или наличию клинической картины. В качестве диагностического критерия используются микроскопические критерии Нюджента и клинические критерии Амсела. По литературным данным, критерии Ньюджента, основанные на количественном соотношениии морфотипов микроорганизмов стали «золотым диагностическим стандартом». Но этот метод сложен, субъективен, требует стандартизации, а количественная оценка не является точной.

На сегодняшний день помимо общеизвестных маркёров бактериального вагиноза - снижение лактофлоры и увеличение Gardnerella vaginalis, - значительное внимание стало уделяться другим анаэробным бактериям, которые ассоциированы с бактериальным вагинозом: Atopobium vaginae и Mobiluncus sp. В ряде зарубежных работ было показано, что с этими микроорганизмами связана резистентность бактериального вагиноза к метронидазолу и другим антибиотикам, наиболее часто применяемым при лечении БВ, и соответственно высокая вероятность возникновения рецидива после проводимой терапии. Однако выявление чувствительного и специфического агента бактериального вагиноза Atopobium vaginae при микроскопическом исследовании затруднено, т.к. он по морфологическим признакам относится к лактоподобным бактериям (грамм-положительные эллиптические кокки или палочковидные микроорганизмы).

Цели исследования: Целями нашего исследования стала оценка частоты встречаемости и количественной нагрузки анаэробных микроорганизмов: Gardnerella vaginalis,Atopobium vaginae и Mobiluncus sp. как маркёров бактериального вагиноза в группах с различной концентрацией Lactobaccillus sp.

Материалы и методы: 1. Олигонуклеотиды (праймеры и зонды) для амплификации Аtopobium vaginaе были выбраны видоспецефичными на ген 16S рРНК, олигонуклеотиды для амплификации Mobiluncus sp. выбраны родоспецифичными также на ген 16S рРНК. Для дизайна олигонуклеотидных последовательностей использовался пакет программ Vector NTI 9 (InforMax Inc., 2003), для оценки аналитической специфичности использовался Интернет ресурс «NCBI Blast!» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 2. Для количественной оценки Lactobaccillus sp. и Gardnerella vaginalis использовалась тест-система «Амплисенс Gardnerella vaginalis/Lactobaccillus sp.- Титр-FRT» (производство ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). 3. Исследование было проведено на 104 клинических образцах урогенитальных мазков женщин. Все образцы были взяты в 500 мкл транспортной среды Амплисенсâ женская (производство ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Выделение ДНК проводилось набором «ДНК-Сорб-А» (производство ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора).

Результаты: В ходе исследования образцов урогенитального тракта было определено количество аэробных Lactobaccillus sp. методом ПЦР в режиме реального времени. Концентрация в них составила от  0,5 до 8,0 lg. Для дальнейщего исследования мы оставили 95% образцов, в которых концентрация Lactobaccillus sp. составила от 1,4 до 7,9 lg, таких образцов было 98, остальные мы исключили из анализа как возможные выбросы.

Доказанным на сегодняшний день является то, что в норме концентрация лактофлоры не ниже 6 lg. По нашим данным в группе из 98 человек медиана концентрации Lactobaccillus sp. была на уровне 5,5 lg. В соответствии с этими результатами мы разделили все образцы на 2 группы: со сниженной концентрацией Lactobaccillus sp. (т.е. ниже 5,5 lg, 47 образцов) и с нормальной концентрацией Lactobaccillus sp. (т.е. выше 5,5 lg, 51 образец). Во всех образцах мы определили наличие анаэробной Gardnerella vaginalis. Общая выявляемость Gardnerella vaginalisсоставила 68,4% (67 образцов из 98). При сравнении двух групп в зависимости от количества Lactobaccillus sp. выявляемость Gardnerella vaginalis практически не отличалась, однако разница в медиане концентрации составила 3 порядка.

Gardnerellavaginalis
	Lactobaccillussp. < 5,5 lg (N=47)	Lactobaccillussp. ≥ 5,5 lg (N=51)
Выявляемость, % (чел.)	74,5% (35 чел.)	62,7% (32 чел.)
Концентрация, медиана, lg ± ст.откл, lg.	5,0 ± 2,1	2,7 ± 2,0

 

В последнее время большое значение в развитии дизбиоза урогенитального тракта стали уделять Mobiluncus sp. и Аtopobium vaginaе, открытому в конце 90-ых. Эти микроорганизмы также являются анаэробными и при снижении концентрации защитной аэробной лактофлоры, создаётся благоприятная среда для замещения аэробными микроорганизмами. Кроме того, с Mobiluncus sp. и Аtopobium vaginaе связывают развитие резистентности к антибиотикам наиболее часто применяемым при лечении бактериального вагиноза и высокую частоту рецидивов после проведённой терапии. В нашей работе была определена общая выявляемость Аtopobium vaginaе и Mobiluncus sp., которая составила для Аtopobium vaginaе - 54,1% (53 из 98), для Mobiluncus sp. -  64,3% (63 из 98). Выявляемость по группам в зависимости от концентрации Lactobaccillus sp. отличалась только для Аtopobium vaginaе: встречаемость при сниженной концентрации Lactobaccillus sp. была выше. Однако концентрация этих анаэробных микроорганизмов зависела от количества лактофлоры.

Аtopobiumvaginaе
	Lactobaccillussp. < 5,5 lg (N=47)	Lactobaccillussp. ≥ 5,5 lg (N=51)
Выявляемость, % (чел.)	61,7% (29 чел.)	49,0% (25 чел.)
Концентрация, медиана, lg ± ст.откл, lg.	6,0 ± 3,0	1,7 ± 2,2
Mobiluncus sp.
	Lactobaccillussp. < 5,5 lg (N=47)	Lactobaccillussp. ≥ 5,5 lg (N=51)
Выявляемость, % (чел.)	66,0% (31 чел.)	60,8% (31 чел.)
Концентрация, медиана, lg ± ст.откл, lg.	2,4 ± 2,1	1,6 ± 1,0

 

Выводы: 1.Согласно полученным нами данным качественное выявление анаэробных микроорганизмов: Gardnerella vaginalis, Аtopobium vaginaе, Mobiluncus sp. без учёта количественного результата не оправдано. Т.к. по нашим результатам общая встречаемость этих микроорганизмов более 50% и практически не коррелирует с количеством лактофлоры урогенитального тракта. Но вместе с тем концентрация анаэробных микроорганизмов находится в прямой зависимости от количества Lactobaccillus sp. и максимальная разница наблюдается для Аtopobium vaginaе, концентрация которого более чем на 3 lg (в 1000 раз) превосходит таковую в случае угнетения лактофлоры, для Gardnerella vaginalis эта разница составляет более 2 lg (100 раз), для Mobiluncus sp. эта разница является ниаменьшей среди этих трёх микроорганизмов и составляет чуть менее 1 lg (10 раз). Однако для Mobiluncus sp. максимальные концентрации в группе со сниженной концентрацией Lactobaccillus sp. на 2 порядка (100 раз) превышают таковуюв группе с нормальной концентрацией Lactobaccillus sp. И встречаемость Mobiluncus sp. в концентрации превышающей 2,4 lg в группе со сниженной концентрацией лактофлоры более чем в 2 раза выше, чем в группе с нормальной концентрацией лактофлоры (36% (17 пациентов из 47) и 17% (9 из 51) соответственно).

2. Эти микроорганизмы: Gardnerella vaginalis, Аtopobium vaginaе и Mobiluncus sp. могут являться маркёрами дизбиоза урогенитального тракта. Выявляемость Аtopobium vaginaе и Mobiluncus sp. сходна с выявляемостью Gardnerella vaginalis. Однако требуется дальнейшее проведение исследования на наличие молекулярных маркёров бактериального вагиноза относительно клинически валидированных образцов и определение значимости каждого из этих микроорганизмов для бактериального дизбиоза урогенитально тракта.