Перспективы использования ВПЧ-тестов «Амплисенс» для скрининговой диагностики предраковых заболеваний шейки матки в России

Перспективы использования ВПЧ-тестов «Амплисенс» для скрининговой диагностики предраковых заболеваний шейки матки в России

Этиологической причиной развития рака шейки матки (РШМ) является вирус папилломы человека (ВПЧ), который передается половым путем. И поскольку, РШМ - инфекционное заболевание, наиболее надежным средством его профилактики, безусловно, является тотальная вакцинация женского населения. Но, несмотря на большие успехи в разработке и внедрении вакцин против наиболее частых канцерогенных типов ВПЧ, на сегодняшний день в мире пока еще наиболее важным методом профилактики РШМ является апробированный и хорошо изученный метод вторичной профилактики – тотальное обследование (скрининг) женского населения на наличие маркеров предраковой стадии папилломавирусной инфекции (ПВИ) - цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН). Хорошо известно, что в большинстве экономически развитых стран Европы и Северной Америки внедрение программ скрининга позволило значительно снизить заболеваемость РШМ. Однако, в развивающихся странах, на долю которых приходится наибольшее количество случаев заболевания в мире, традиционные программы скрининга оказались неэффективными.

Следует заметить, что основное требование, которому должны отвечать программы скрининга – это высокая эффективность и низкая стоимость. Эффективность выявления женщин группы риска РШМ зависит от нескольких параметров: охват женского населения, чувствительность используемого метода и периодичность проведения исследований. При использовании  цитологического метода скрининга, начиная с возраста 25-30 лет с 3-5-летним интервалом и не менее 75%-ном охвате женского населения удается достичь снижения заболеваемости РШМ на 70-80%. Но это при условии высокой (не менее 85%) чувствительности цитологического метода. Однако, основным недостатком этого метода как раз является его низкая чувствительность, варьирующая в пределах 40-70%, составляя в среднем 50% (McCrory D., 2002; Wright T., 2004). Причины такой низкой чувствительности метода обсуждаются. По одним данным, в 70-90% случаев причиной ложноотрицательных цитологических ответов является плохой забор материала для исследования и в 10-30% - ошибочная интерпретация цитологических данных. По другим данным, наоборот, отмечается низкий конкорданс между лабораториями при тестировании одних и тех же препаратов – от 11 до 80%. Кроме того, высока доля сомнительных результатов (до 15% ASCUS, ASC-H), требующих повторных и подтверждающих исследований. Таким образом, предсказательная ценность отрицательного результата оказывается низкой, что требует более частого проведения исследований и приводит к удорожанию программы скрининга. В связи с этим, в последние годы в скрининге все больше стали использоваться тесты, позволяющие выявлять ДНК ВПЧ (ВПЧ-тесты). Многочисленные исследования показали, что эти тесты обладают более высокой чувствительностью выявления ЦИН, чем цитологические, что получение отрицательного результата ВПЧ-теста позволяет значительно увеличить интервал между повторными тестированиями. На основании данных крупных международных исследований сформулированы рекомендации по применению ВПЧ-теста в скрининговых программах:

- в первичном скрининге у женщин старше 30 лет в сочетании с цитологическим исследованием или в качестве самостоятельного теста (в странах, где плохо организованы программы цервикального цитологического скрининга),

- для разрешения сомнительных результатов цитологического исследования,

- для мониторинга терапии цервикальных поражений высокой степени – ЦИН 2+ (т.е. ЦИН 2/3, рак in situ, инвазивный рак).

Во многих странах совместное применение ВПЧ-теста и цитологического ПАП-теста позволило увеличить чувствительность выявления ЦИН до 99-100%, удлинить сроки проведения исследований до 5-7 лет, что, несмотря на использование дополнительного метода исследования, в конечном итоге привело к снижению затрат на программу скрининга. Разработан принципиально новый способ забора клеток цервикального эпителия в транспортно-фиксирующую среду для одновременного проведения цитологического исследования (жидкостная цитология) и ВПЧ-теста. Такой подход позволил, с одной стороны, увеличить эффективность цитологического метода, а с другой – с помощью ВПЧ-теста сразу разрешать сомнительные результаты цитологического анализа без повторного забора клинического образца.

Важным преимуществом ВПЧ-теста является значительно более высокая пропускная способность лабораторий. Так, например, опытный врач-цитолог может просмотреть не более 30-35 препаратов за рабочий день, затрачивая не менее 10-15 минут на один препарат. Увеличение нагрузки неизбежно приведет к снижению эффективности диагностики, поскольку главным «инструментом исследования» являются глаза. А при использовании современных ВПЧ-тестов один врач-лаборант может протестировать не менее 180 образцов за рабочий день. При разделении этапов ВПЧ-теста на основе ПЦР-анализа с привлечением труда лаборанта на этапе пробоподготовки, пропускная спобность лаборатории увеличивается вдвое.

Оценка диагностической чувствительности рекомендованного для скрининга ВПЧ-теста, которая в среднем составляет 88-100%, значительно превышает чувствительность цитологического исследования, а диагностическая специфичность скринингового ВПЧ-теста при использовании его в возрастной группе женщин более 30 лет лишь немного уступает специфичности цитологического метода (78-99%). Прогностическая значимость отрицательного теста на ДНК ВПЧ приближается к 100%. Это является основанием для использования ВПЧ-теста в первичном скрининге. В настоящее время предложены и апробированы алгоритмы применения ВПЧ-теста на первом этапе скрининга (Cuzick J. 2002, 2003, 2006).

 

На основании многолетнего мирового опыта применения различных молекулярно-биологических методов для выявления ДНК ВПЧ в скрининговых программах к настоящему времени сформулированы четкие требования к ВПЧ-тестам, которые могут быть использованы в скрининге:

- ВПЧ-тест должен выявлять только типы вируса, которые относятся к группе высокого канцерогенного риска (ВКР), т.к. выявление всех типов вируса, включая группу низкого онкогенного риска, которые не вызывают трансформации эпителиальных клеток, будет приводить к значительному снижению специфичности теста;

- ВПЧ-тест должен выявлять широкий спектр типов ВКР, не менее 10-12 типов, т.к. это обеспечивает более чем 95%-ную чувствительность теста. Выявление только ВПЧ 16 и 18 типов будет приводить к значительному снижению чувствительности скрининга, поскольку эти два типа ответственны не более чем за 70-80% ЦИН 2+;

- ВПЧ-тест должен обладать высокой диагностической чувствительностью и специфичностью выявления ЦИН 2+. Это обеспечивается способностью теста выявлять только клинически значимую концентрацию вируса или дифференцировать клинически значимую от незначимой;

- ВПЧ-тест должен быть стандартизованным, начиная с этапа забора материала, простым и быстрым в исполнении, недорогим, учет результатов анализа должен быть автоматизирован.

Тесты для выявления и генотипирования ВПЧ, основанные на методах гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР), начали применять еще более 10 лет назад. Однако все эти тесты и методики могли использоваться лишь в научно-исследовательских целях, поскольку они сильно отличаются друг от друга по аналитической чувствительности и спектру выявляемых типов. Очевидно, что в программах скрининга могут быть использованы только стандартизованные тесты, удовлетворяющие заданным требованиям по чувствительности и специфичности и прошедшие клиническую апробацию.

Первый ВПЧ-тест, который был одобрен FDA в 2003 году, а затем, после проведения широких испытаний в разных странах мира, рекомендован для скрининга, был «Hybrid Capture 2 High Risk HPV DNA Test» фирмы «Digene» (США). В основе теста лежит методика гибридизации ДНК ВПЧ со специфическими РНК-пробами в растворе с последующим вылавливанием и проявлением ДНК-РНК гибридов с помощью моноклональных антител. В настоящее время этот тест разрешен для применения в России. Но, высокая стоимость теста ограничивает возможности его использования в российских программах скрининга. Тем не менее, поскольку этот тест удовлетворяет практически всем требованиям скринингового ВПЧ-теста, он в обязательном порядке должен использоваться для валидации вновь разработанных отечественных скрининговых ВПЧ-тестов.

В течение прошедших 10 лет в нашей стране наиболее используемым методом выявления ДНК ВПЧ и определения типа вируса являлась ПЦР в качественном варианте. Это связано с тем, что с 1993 года метод ПЦР стал активно распространяться в России и использоваться для диагностики различных инфекций, в том числе и ПВИ. На сегодняшний день следует констатировать тот факт, что в России уже существует и продолжает организовываться целая система лабораторий, использующих ПЦР для решения самых разных задач. Многие отечественные коммерческие тест-системы для диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, некоторых ИППП в настоящее время являются хорошо изученными, апробированы в сравнении с мировыми аналогами и разрешены для использования. Созданы российские производства ПЦР-тест-систем. В России в настоящее время разработаны, зарегистрированы и производятся также и различные тесты для выявления ДНК ВПЧ. Однако большинство из них не удовлетворяют требованиям, предъявляемым к ВПЧ-тестам для скрининга. Спектр выявляемых генотипов ВПЧ, аналитическая чувствительность и специфичность отечественных ВПЧ-тестов сильно варьируют в зависимости от способа забора и обработки клинического образца, дизайна праймеров и качества реагентов, а также способа детекции продуктов ПЦР. Несмотря на повсеместное применение отечественных ПЦР-тестов для диагностики ВПЧ-инфекции, нельзя признать, что все они стандартизованы, прошли должную клиническую апробацию и испытаны в скрининговых исследованиях.

В последние годы, в связи с реанимацией в России системы диспансеризации населения, снова внедряются программы цервикального скрининга. Так, в Москве и Омске уже в течение нескольких лет проводится организованный цитологический скрининг женского населения. Однако эффективность скрининга пока еще остается низкой по многим причинам. Одна из них – недостаток ресурсов для проведения цитологических исследований на должном уровне. В связи с этим, в настоящее время предпринимаются усилия по стандартизации ПЦР-тестов, направленных на выявление ВПЧ высокого канцерогенного риска. В 2004 году по заказу Департамента Здравоохранения Правительства Москвы были разработаны и к настоящему времени уже достаточно апробированы первые отечественные ВПЧ-тесты «АмплиСенс ВПЧ-скрин EP», «АмплиСенс ВПЧ-скрин FEP», «АмплиСенс ВПЧ-скрин-титр FRT» предназначенные непосредственно для скрининга и удовлетворяющие всем требованиям скрининговых ВПЧ-тестов:

- тесты выявляют только ДНК ВПЧ типов высокого канцерогенного риска и выявляют не менее 10-12 типов ВПЧ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59);

- забор образца для исследования стандартизован, тесты адаптированы для работы с образцами, помещенными в различные транспортные среды («АмплиСенс», «Digene»), включая транспортно-фиксирующую среду для проведения жидкостной цитологии;

- тесты обладают высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, т.к. могут отличать клинически значимые и клинически незначимые концентрации ДНК ВПЧ в образце;

- тесты «АмплиСенс ВПЧ-скрин FEP», «АмплиСенс ВПЧ-скрин-титр FRT» являются частично автоматизированными, учет результатов анализа выполняется с помощью специальной программы, выдающей конечный результат в удобной и понятной для врача-клинициста интерпретации цифровых данных прибора;

- тесты «АмплиСенс» разработаны на основе трех различных технологий выполнения ПЦР-анализа: ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации (EP), ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной «по конечной точке» (FEP) и ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (FRT), последний тест является количественным. Любые ПЦР-лаборатории, в зависимости от оснащения, могут выполнять скрининговое ВПЧ-тестирование выбирая тест под оборудование лаборатории.

ВПЧ-тесты «АмплиСенс» производятся на единственном в России сертифицированном (ISO 9001/ISO 13485) производстве ПЦР-тест-систем. С целью стандартизации тестов научной группой производства была разработана панель количественно охарактеризованных контрольных образцов, содержащих клонированные полные геномы ДНК ВПЧ. Контрольные образцы содержат как специфические для тестов типы ВПЧ (16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) в концентрации 10³,10⁴ и10⁵ копий ДНК/мл, так и неспецифические для тестов типы ВПЧ (11, 53, 66, 73) в концентрации 10⁷ копий ДНК/мл.

ВПЧ-тесты «АмплиСенс» валидированы относительно тест-системы «HC2 HPV DNA test» на положительных и отрицательных контрольных образцах этой тест-системы и панели образов «HC2 Training Panel» («Digene», США) содержащей фрагменты генов E6E7L1 ДНК ВПЧ 16 типа в различных концентрациях и на контрольных образцах панели «АмплиСенс».

ВПЧ-тесты «АмплиСенс» валидированы на клинических гистологически верифицированных образцах от женщин с дисплазиями шейки матки (CIN2+) и образцах от здоровых женщин, верифицированных двойным цитологическим исследованием.

 

Определение аналитической чувствительности

Аналитическая чувствительность ПЦР-тест-системы – это минимальное количество копий специфической ДНК, которое тест-система выявляет в 100% тестирований. Аналитическую чувствительность ВПЧ-тестов «АмплиСенс» определяли с использованием количественно охарактеризованных положительных контрольных образцов (КО) и их разведений (готовили 10-ти и 100-кратные разведения положительного контроля) из тест-системы и тренировочной панели фирмы «Digene» тестируя параллельно с препаратом сравнения «HC2 HR HPV DNA test». Результаты тестирования представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Результаты тестирования контрольных образцов (КО) с помощью трех испытуемых ВПЧ-тестов «АмплиСенс» (EP, FEP, FRT) и контрольного теста «HC2 HPV DNA test» (HC2).

КО	Источник	Тип ВПЧ	Концентрация ДНК ВПЧ (копий/мл)	Результаты тестирования (+\-)
				HC2	EP	FEP	FRT
HRC (калибратор)	HC2	16	105	+	+	+	+
HRC/10	HC2 TP	16	104	-	+	+	+
HRC/100	HC2 TP	16	103	-	+	+	+
NC	HC2	нет	0	-	-	-	-
NC	HC2	нет	0	-	-	-	-
QC-HR	HC2	16	5*105	+	+	+	+
TP A	HC2 TP	16	106	+	+	+	+
TP B	HC2 TP	6	106	-	-	-	-

 

Таким образом, аналитическая чувствительность ПЦР-тестов «АмплиСенс» превышает аналитическую чувствительность контрольного теста, т.е. ПЦР-тесты способны выявлять значительно меньшие количества ДНК ВПЧ в образце, чем выявляет «HCII HR HPV DNA test». . Чувствительность ПЦР-тестов составляет 10³ копий ДНК/мл, а чувствительность «HCII HR HPV DNA test» составляет 10⁵ копий ДНК/мл, т.е. в 100 раз меньше чувствительности ПЦР.

Более высокая аналитическая чувствительность ВПЧ-тестов «АмплиСенс» неизбежно приводит к уменьшению их специфичности в скрининге. С целью достижения высокой специфичности ПЦР-тестов «АмплиСенс» мы разработали и использовали простой подход, основанный на 100-кратном разведении ДНК из клинического образца. С помощью такого подхода нам удалось достичь высокой специфичности теста без потери его чувствительности. Результаты тестирования клинических образцов, валидированных с помощью теста HC2 в вариантах с разведением и без разведения образца представлены в таблицах 2а и 2б.

 

Таблица 2а. Чувствительность и специфичность «АмплиСенс ВПЧ-скрин EP» в вариантах с разведением образца и без разведения в сравнении с HC2-тестом.

«HC2 HR HPV DNA test»	Число «+» Образцов=77	Чувствительность (%)	Число «-» Образцов=108	Специфичность (%)
без разведения образца	76	98.7	94	87.0
с разведением образца	76	98.7	105	97.2

 

Таблица 2б. Чувствительность и специфичность «АмплиСенс ВПЧ-скрин FEP» в вариантах с разведением образца и без разведения в сравнении с HC2-тестом.

«HC2 HR HPV DNA test»	Число «+» Образцов=74	Чувствительность (%)	Число «-» Образцов=98	Специфичность (%)
без разведения образца	65	91.5	94	89.8
с разведением образца	65	91.5	105	93.9

 

Тест «АмплиСенс ВПЧ-скрин FEP» показал более низкую чувствительность выявления ВПЧ в образцах. Это может быть связано с меньшим спектром выявляемых генотипов в этом тесте.

 

Количество выявляемых генотипов

В зависимости от количества выявляемых генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска диагностическая чувствительность и специфичность разных ВПЧ-тестов может отличаться. Поэтому в аннотациях к тестам обязательно указывается какие типы ВПЧ-тест может выявлять. Так, например, в аннотации к «HCII HR HPV DNA test» заявлено, что тест выявляет 13 генотипов ВПЧ (16, 18, 31, 33, 35, 49, 41, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68). Для оценки специфичности ВПЧ-тестов мы использовали контрольные образцы производственной панели, содержащей полные геномы 15-ти различных типов ВПЧ в концентрации 10⁵ копий ДНК/мл для специфических типов и 10⁷ копий ДНК/мл для неспецифических типов. Результаты тестирования представлены в таблице 3.

 

Таблица 3. Тестирование образцов контрольной панели в ВПЧ-тестах «Digene» и «Амплисенс».

 

Из таблицы 2 видно, что наибольшее число типов выявляют тест-системы «HCII HR HPV DNA test» и «АмплиСенс ВПЧ-скрин EP», причем первая тест-система выявляет кроме заявленных в аннотации 13 типов также незаявленные 53 и 66 типы, которые принадлежат к той же филогенетической группе α6, что и 56-ой тип ВПЧ, поэтому генетически близки и, очевидно, не дифференцируются в реакции гибридизации с РНК-зондами, охватывающими почти всю последовательность ДНК ВПЧ. Также очевидно, что эти типы не дифференцируются в ПЦР с группоспецифическими праймерами и электрофоретической детекцией продуктов амплификации. При использовании группоспецифических праймеров дифференцировать разные типы ВПЧ внутри филогенетической группы возможно только при использовании гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации с помощью типоспецифических зондов (варианты FEP и FRT тест-систем «АмплиСенс»).

Следует заметить, что увеличение количества выявляемых генотипов не обязательно приводит к увеличению диагностической чувствительности ВПЧ-теста, но может приводить к снижению диагностической специфичности. Поэтому недостаточно валидировать ВПЧ-тесты только по отношению к одобренному для скрининга «HCII HR HPV DNA test», необходимо валидировать их на клиническом материале.

 

Определение диагностической чувствительности и специфичности

Диагностическая чувствительность и специфичность ВПЧ-тестов «АмплиСенс» в выявлении тяжелых дисплазий (В-ПИП/H-SIL) оценивалась на гистологически верифицированных образцах от пациенток с дисплазией высокой степени тяжести и образцах от здоровых женщин двух групп – моложе и старше 30 лет - верифицированных двойным слепым цитологическим исследованием как «норма».  Результаты тестирования образцов в ВПЧ-тестах «АмплиСенс» представлены в таблицах 4а и 4б.

 

Таблица 4а. Диагностическая чувствительность и специфичность теста «АмплиСенс ВПЧ-скрин EP» в вариантах с разведением и без разведения образца.

Диагноз, количество образцов	В-ПИП, образцов=83	Чувствительность (%)	Норма, образцов=516	Специфичность (%)
без разведения образца	82	98.8	331	64.1
с разведением образца	81	97.6	430	83.3

 

Таблица 4б. Диагностическая чувствительность и специфичность теста «АмплиСенс ВПЧ-скрин FEP» в вариантах с разведением и без разведения образца.

Диагноз, количество образцов	В-ПИП, образцов=87	Чувствительность (%)	Норма, образцов=214	Специфичность (%)
без разведения образца	86	98.9	132	61.7
с разведением образца	86	98.9	181	84.6

 

Следует отметить, что если в общей контрольной группе выделить группу женщин старше 30-ти лет, т.е. целевую группу скрининга, то специфичность ВПЧ-теста увеличивается. Так, в возрастной группе старше 30 лет специфичность в тесте без разведения составила 73,9% (221 из 299 образцов), а в тесте с разведением – 88,9% (266 из 299 образцов).

В настоящее время ВПЧ-тесты «АмплиСенс» завершают государственные испытания и проходят апробацию в российских программах цервикального скрининга.

Заключение

Таким образом, в настоящее время разработаны и производятся первые российские стандартизованные ВПЧ-тесты, удовлетворяющие всем требованиям, предъявляемым к ВПЧ-тестам для скрининга. Тесты валидированы по отношению к рекомендованному для скрининга мировому стандарту «Hybrid Capture 2 High Risk HPV DNA Test», прошли широкую клиническую апробацию и могут использоваться в российских программах скрининга.