Разработка и апробация тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации видов уреаплазм и определения их концентрации в образцах из урогентального тракта

Разработка и апробация тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциации видов уреаплазм и определения их концентрации в образцах из урогентального тракта

Бактерии рода Ureaplasma в настоящее время относят к условно-патогенным микроорганизмам, а медицинский термин "уреаплазмоз" официально не применяется. Под уреаплазмозом понимают воспалительный процесс в мочеполовых органах, когда при лабораторном обследовании обнаружена Ureaplasma и не выявлены безусловно- патогенные микроорганизмы, способные вызвать данное воспаление. Зависимость между инфицированием уреаплазмой и развитием острого воспалительного процесса остается недоказанной. Также пока обсуждается, но не доказана возможность проникновения уреаплазм через плодные оболочки, с последующим инфицированием плода, а также то, что уреаплазмы могут являться этиологической причиной преждевременных родов или рождения детей с дыхательной недостаточностью.

Распространенность уреаплазменной инфекции среди женщин детородного возраста чрезвычайно высока и в подавляющем большинстве случаев эта инфекция протекает в бессимптомной форме. Считается, что при бессимптомном течении, обсемененность слизистых оболочек уреаплазмой (концентрация в мл образца) низкая – 10³ КОЕ/мл, а концентрация 10⁴ КОЕ/мл считается клинически значимой. При этом в литературе отсутствуют публикации о каких-либо серьезных исследованиях, подтверждающих обоснованность этого утверждения.

Для определения титра живых уреаплазм в клиническом материале используют бактериологический метод – микрокультуральный тест, основанный на 10-кратных последовательных разведениях клинического материала с последующим посевом и определением титра колониеобразующих единиц (КОЕ) или цветообразующих единиц (ЦОЕ). Длительность проведения исследования, возможность ошибки при разведении образца, тенденция уреаплазм к агрегации, влияние сопутствующей микрофлоры или принимаемых препаратов на рост уреаплазм ограничивают точность метода и влияют на правильность оценки клинической значимости этого лабораторного маркера.

Важным недостатком культурального метода является невозможность дифференцировать виды Ureaplasma (U.parvum и U.urealyticum), т.к. в последнее время накоплено большое количество данных, свидетельствующих о разной степени патогенности этих двух видов. Так, доказано, что U.urealyticum может вызывать воспалительные заболевания, уретриты и цервициты, а U.parvum с высокой частотой обнаруживается в урогенитальном тракте здоровых женщин без жалоб и патологий. Частота обнаружения уреаплазм в группе здоровых беременных женщин возрастает до 70-80%, причем в большинстве случаев выявляется U.parvum в высоком титре.

Цель.

Целью нашей работы явилась разработка тест-системы для одновременной дифференциации двух видов уреаплазм – U.parvum и U.urealyticum и определения их концентрации в клинических образцах на основе ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени, а также апробация ее на контрольных образцах и клиническом материале в сравнении с микрокультуральным тестом «Уреаплазма Микротест», который успешно прошел испытания и получил разрешение для использования в медицинской практике в России.

Материалы и методы.

На основе мультипраймерной полимеразной цепной реакции в реальном времени нами была разработана тест-система «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT» для дифференциации и количественного определения ДНК двух видов уреаплазм - Ureaplasma parvum и Ureaplasma urealyticum. В качестве мишени для амплификации в геноме микроорганизма был выбран однокопийный ген уреазы, на который были выбраны три праймера для амплификации, один из них общий, узнающий ДНК обоих видов уреаплазм, два другие – дифференцирующие. Также были выбраны два флуоресцентно меченных зонда, один, меченный флуоресцентным красителем Fam, специфичный для U.parvum, другой, меченный красителем R6G, специфичный для U.urealyticum. В тесте также используется внутренний стандарт – количественно охарактеризованный неконкурентный внутренний контроль, который предназначен для стандартизации и учета эффективности всех этапов ПЦР-анализа и используется для расчета точной концентрации микроорганизма в объеме клинического образца. Для амплификации и выявления ВК выбраны праймеры и зонд, меченный флуорофором Rox.

Для расчета концентрации ДНК U.parvum и ДНК U.urealyticum в стандартном объеме клинического образца, в который помещен стандартный объем клинического материала, необходимо знать количество копий ДНК U.parvum, U.urealyticum и ВК в реакционной пробирке, а также количество копий ДНК ВК, добавленное в каждый исследуемый образец на этапе пробоподготовки. Первые три значения мы получаем из данных прибора, измеряющего количество единиц флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации и сравнивая их со значениями флуоресцентных сигналов в контролях-калибраторах, образцах, в которых находится ДНК U.parvum, U.urealyticum и ВК в известной нам концентрации. А концентрацию ДНК ВК в образце мы получаем из вкладыша в инструкцию к тест-системе, в котором вписаны результаты измерений данной серии контрольных образцов. Пользуясь формулой расчета концентрации и электронными таблицами Excel можно автоматически получить искомые значения для большого массива исследуемых образцов за несколько минут, всего лишь скопировав данные с прибора и вставив их в нужные колонки электронной таблицы. Принципиальным отличием от культурального исследования, результаты которого учитываются визуально, а поэтому высок риск ошибок, которые может допускать лаборант, в количественном ПЦР-тесте исходные данные и результаты исследования хранятся в лабораторной базе и всегда доступны.

Разработанная тест-система была апробирована на разведениях стандартных культур U.parvum (контрольный штамм 468-1) и U.urealyticum (контрольный штамм 2T-2),  концентрация живых микроорганизмов в которых измерялась стандартным методом лимитирующих разведений. Аналитическая чувствительность теста составила 500 копий ДНК/мл для обоих штаммов. Диапазон линейного измерения составил – от 10³ до 10⁷ копий в мл. Результаты определения средней по 10 измерениям концентрации целевых микроорганизмов в контрольных штаммах представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Результаты измерения ДНК уреаплазм в контрольных образцах культуральным методом и с помощью ПЦР в реальном времени.

Штамм (вид)	Концентрация ДНК Ureaplasma(копий/мл)	Титр U.p./U.u. (ЦОЕ/мл)
468-1 (U.parvum)	7.9*105	2.0*105
2T-2 (U.urealyticum)	2.0*106	3.2*105

 

Концентрация уреаплазм в культуральной жидкости U.parvum и U.urealyticum по данным культурального теста ниже концентрации по уреаплазм по данным ПЦР-теста в 4 и 6 раз ниже, соответственно. Это связано с тем, что в культуральном тесте, в отличие от ПЦР, выявляются только жизнеспособные микроорганизмы. А в любом микробиологическом сообществе, в данном случае, чистой культуре микроорганизмов, находящейся в конце логарифмической фазы роста, одновременно существуют как жизнеспособные, так и нежизнеспособные микроорганизмы, которые не выявляются бактериологическими методами. Таким образом, по нашим данным, в исследуемой культуре U.parvum доля жизнеспособных клеток составляет 25% от всей массы уреаплазм, а в культуре U.urealyticum она составляет 16%.

Воспроизводимость результатов количественных измерений изучали на образцах вагинального отделяемого при тестировании нескольких аликвот из одного и того же образца (на семи образцах, содержащих U.parvum в концентрации от 8*10⁴ до 5*10⁶ копий/мл). А также нескольких последовательных получений вагинального отделяемого из разных зон задненижнего свода влагалища от одной и той же пациентки (материал забранный от двух пациенток содержал U.parvum в концентрации 1.3*10⁶ и 7.6*10⁵ копий/мл). В первом случае коэффициент вариации (CV) находился в пределах от 4,2% до 13,1%, что свидетельствует о высокой точности метода измерения. Во втором случае он составил 14.3 и 34.1%, соответственно, разница логарифмов концентраций не была более 0.4, и это означает, что степень обсемененности уреаплазмами вагинального эпителия одинакова, независимо от зоны.

Для апробации новой тест-системы на клиническом материале в сравнении с культуральным тестом были собраны образцы цервикального канала и отделяемого влагалища от женщин, обратившихся к гинекологу по поводу заболеваний шейки матки или беременных женщин, проходящих плановый осмотр. Образцы собирали в стерильную транспортную среду для культурального теста и затем тестировали на наличие уреаплазм культуральным тестом и с помощью ПЦР-теста «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT». Всего было протестировано 81 образцов. Результаты выявления уреаплазм обоими методами представлены в таблице 2. В таблице 3 представлены значения концентраций ДНК уреаплазм в образцах, давших отрицательный результат в культуральном тесте. Данные по распределению видов уреаплазм в группе ПЦР-положительных образцов представлены в таблице 4. Данные по соотношению значений концентраций уреаплазм, полученных в культуральном тесте и с помощью количественного ПЦР-теста представлены в таблице 5.

 

Таблица 2. Результаты выявления U.parvum и U.urealyticum в клинических образцах.

	«Уреаплазма Микротест» положительный	«Уреаплазма Микротест» отрицательный
«АмплиСенс U.p./U.u.–титр-FRT»  положительный	43	8
«АмплиСенс U.p./U.u.-титр-FRT» отрицательный	0	30

 

 Таблица 3. Результаты определения концентрации U.parvum и U.urealyticum в клинических образцах, давших отрицательный результат в культуральном тесте.

образец	Вид Ureaplasma	Копий ДНК/мл	lg копий ДНК/мл
18	U.parvum	8.2*104	4.9
19	U.parvum	9.1*105	5.0
20	U.urealyticum	7.6*102	2.9
73	U.parvum	9.2*105	6.0
76	U.parvum	1.8*104	4.3
104	U.parvum	2.0*103	3.3
106	U.urealyticum	4.4*104	4.6
116	U.parvum	8.2*102	2.9

 

Таблица 4. Распределение видов уреаплазм в группе ПЦР-положительных образцов.

Вид Ureaplasma	Количество образцов	% от общего числа положительных	Средняя концентрация (lg копий/мл)
U.parvum	37	72,5	5.4 (2.3 – 6.7)
U.urealyticum	12	23,5	5.3 (2.9 – 7.0)
U.parvum+ U.urealyticum	2	3,9	5.8, 5,9

 

Таблица 5. Значения концентраций уреаплазм, полученные в культуральном тесте и с помощью количественного ПЦР-теста.

Титр уреаплазм по данным культурального теста	Образцов в группе	Среднее и разброс значений концентрации ДНК уреаплазм в ПЦР-тесте (lg копий ДНК/мл)
106	16	6.1 (4.6 – 6.0)
105	11	5.3 (3.5 – 6.4)
104	4	6.2 (6.1 – 6.2)
103	12	5.1 (3.8 – 6.0)

Как видно из данных, представленных в таблицах 2 и 3, чувствительность ПЦР-теста в выявлении уреаплазм выше чувствительности культурального теста, причем, в культуральном тесте не выявлялись положительные образцы, концентрация уреаплазм в которых была достаточно высокой, более10⁴ уреаплазм в мл клинического образца.

Как видно из таблицы 4, образцы, содержащие U.urealyticum составляют примерно четверть от всех положительных образцов, причем концентрация уреаплазм в образце не зависит от ее вида.

Из данных, представленных в таблице 5 следует, что точность определения титра уреаплазм основанного на десятикратных разведениях образца и определения положительного результата с помощью культурального метода значительно уступает точности определения концентрации уреаплазм с помощью количественного ПЦР-теста. Коэффициент корреляции между двумя методами составил 0,43.

             

Заключение.

Таким образом, тест-система «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT», разработанная для дифференциации видов уреаплазм и определения концентрации ДНК уреаплазм в образцах из урогенитального тракта, показала лучшие аналитические характеристики в сравнении с культуральным тестом «Уреаплазма Микротест» и может быть рекомендована для использования в рутинной лабораторной практике.