Разработка и клиническая апробация тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ на основе метода Real-Time ПЦР
Разработка и клиническая апробация тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ на основе метода Real-Time ПЦР
ВведениеПринцип детекции накопления флуоресцентного сигнала в процессе ПЦР-амплификации (Real-Time ПЦР) открыл широкие возможности перед молекулярной диагностикой. Наибольшая ценность данного метода заключается в возможности количественных измерений. Причем, в отличие от традиционных подходов (например, ПЦР с гибридизационно-ферментной детекцией) метод Real-Time ПЦР позволяет проводить количественные измерения в более широком линейном диапазоне за меньшее количество времени.
С этим связано появление в последнее время большого количества новых тест-систем, в основе которых лежит метод Real-Time ПЦР (или ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени). В частности, для диагностики ВИЧ-инфекции за последний год появилось на Российском рынке сразу 3 коммерческие тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ. Одна из них была разработана на базе ЦНИИЭ – «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT». При создании тест-системы за основу была взята ранее разработанная и широко апробированная тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор» с детекцией продуктов амплификации методом гибридизационно-ферментного анализа. В основе этих двух тестов лежит принцип ПЦР-амплификации ВИЧ совместно с внутренним контрольным образцом (ВКО). Причем, ВКО играет роль не только контроля качества проведенного анализа в каждом образце, но и является количественным стандартом, относительно которого рассчитывается концентрация РНК ВИЧ в образце. Это имеет большое значение при работе с клиническим материалом, для которого возможна различная эффективность экстракции нуклеиновых кислот.
Целью настоящей работы было проведение расширенных клинических испытаний тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в сравнении с двумя традиционными ПЦР-тестами «АмплиСенс ВИЧ Монитор» и «CobasAmplicor HIV-1 Monitor v. 1.5».
Материалы и методы.
Пациенты. Было протестировано 126 образцов плазмы крови от ВИЧ-инфицированных пациентов на разных стадиях заболевания из Москвы и Московской области.
Забор крови и подготовка ее к анализу. Кровь забирали у пациентов утром натощак в пробирку с 3%-ным ЭДТА из расчета 1:20. Для получения плазмы цельную кровь центрифугировали при 800-1600 g в течение 20 минут. Плазму хранили при температуре минус 700С.
Определение концентрации РНК ВИЧ. Каждый образец был протестирован параллельно с помощью 3 тест-систем согласно прилагаемым инструкциям:
Тест-система «Cobas AmplicorHIV-1 Monitorv. 1.5»: анализировали 200 мкл образца, экстракцию РНК проводили вручную, ПЦР и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью автомата Cobas Amplicor. Линейный диапазон измерения: от 400 до 750000 копий/мл.
Тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор»: анализировали 100 мкл образца, экстракцию РНК проводили вручную, для амплификации кДНК использовали амплификатор GeneAmp 2400, детекцию продуктов ПЦР проводили вручную методом гибридизационно-ферментного анализа (ГИФА). Линейный диапазон измерения: от 500 до 800000 копий/мл.
Тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT»: анализировали 100 мкл образца, экстракцию РНК проводили вручную, Real-Time ПЦР проводили с помощью прибора RotorGene 3000 (CorbettResearch, Австралия). Линейный диапазон измерения: от 500 до 5000000 копий/мл.
Анализ результатов.
Полученные результаты вирусной нагрузки перед анализом логарифмировали. Если разница логарифмов по одной из тест-систем превышала 0,5, образцы тестировали повторно. Дискордантными результаты считали, если разница логарифмов превышала 0,5 в двух постановках. Рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена.
Секвенирование ДНК ВИЧ. Секвенировали только те образцы, для которых были получены дискордантные результаты. По возможности секвенировали 4 фрагмента генома ВИЧ для определения генотипа: фрагмент гена p24, ген протеазы, фрагмент гена обратной транскриптазы, фрагмент гена gp120. Фрагмент гена обратной транскриптазы секвенировали с целью выяснения возможных причин получения дискордантных результатов, поскольку в области этого гена располагаются места посадки праймеров и зондов в тест-системах «АмплиСенс».
Результаты
Концентрация РНК в 93 образцах (из 126) находилась внутри линейного диапазона трех анализируемых тест-систем. Отличие между результатами менее чем на 0,5 lg наблюдалось в 91% образцов. Результаты вирусной нагрузки, полученные с помощью 3 тест-систем, хорошо коррелировали между собой. Наиболее высокий коэффициент корреляции (по Спирмену) был получен между тест-системами «АмплиСенс»: 0,944.
27 образцов ниже линейного порога детекции было выявлено с помощью тест-системы «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5». Из 27 образцов было обнаружено 3 дискордантных (табл. 1).
В силу низкой концентрации РНК секвенировать дискордантные образцы не представлялось возможным. С целью выяснения причины получения более высоких значений вирусной нагрузки в тест-системах «АмплиСенс» образцы были протестированы после предварительного разведения негативной плазмой в 2 раза. Все 3 образца детектировались в 2-кратном разведении, что говорит о том, что значения, полученные в тест-системе Cobas Amplicor, скорее всего, занижены, поскольку аналитическая чувствительность тестов «АмплиСенс» составляет 300 копий/мл.
Таблица 1.
№ образца |
Cobas Amplicor |
АмплиСенс (ГИФА) |
АмплиСенс FRT |
30 |
< 400 |
1000 |
720 |
52 |
< 400 |
1 280 |
1 540 |
177 |
< 400 |
570 |
770 |
Было выявлено 2 дискордантных образца, для которых были получены результаты ниже линейного порога тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» (табл. 2). В результате секвенирования фрагмента гена обратной транскриптазы было выявлено 4 мисметча в месте посадки зонда для образца № 82. Образец содержит ВИЧ субтипа А. Для образца № 164 (субтип G) было выявлено не более 2 мисметчей в местах посадки праймеров и зонда, что не должно влиять на эффективность выявления ВИЧ. Для эффективного выявления образца № 82 был выбран специальный зонд, который был включен в состав ПЦР-смеси (табл. 5).
Таблица 2.
№ образца |
Cobas Amplicor |
АмплиСенс (ГИФА) |
АмплиСенс FRT |
82 |
1 540 |
1 730 |
< 500 |
164 |
3 990 |
723 |
< 500 |
Было выявлено 4 образца, в которых результаты вирусной нагрузки превышали линейный порог детекции тест-систем «CobasAmplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» и «АмплиСенс ВИЧ Монитор». При этом, с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» удалось получить количественные результаты для этих образцов.
Из 93 образцов, в которых концентрация РНК находилась внутри линейного диапазона 3 тест-систем, было выявлено 8 дискордантных образцов. В 2 образцах наблюдались более низкие значения в тест-системе «Cobas AmplicorHIV-1 Monitorv. 1.5» по сравнению с остальными тестами, в 2 образцах более низкие значения были получены в тест-системе «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT». В 4 образцах тест-системы «АмплиСенс» давали более высокие значения вирусной нагрузки по сравнению с тест-системой «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» (табл. 3).
Таблица 3. Дискордантные результаты (lg копий РНК/мл).
№ образца |
Cobas Amplicor |
АмплиСенс (ГИФА) |
АмплиСенс FRT |
АмплиСенс FRT (М) |
81 |
485 |
1 460 |
2 520 |
|
48 |
72 100 |
258 000 |
251 000 |
|
75 |
53 900 |
32 500 |
14 800 |
|
154 |
238 000 |
112 000 |
71 500 |
|
125 |
31 000 |
68 700 |
103 000 |
|
158 |
9 040 |
25 900 |
43 100 |
|
159 |
29 800 |
93 500 |
185 000 |
|
112 |
1 720 |
3 120 |
5 310 |
|
* Жирным шрифтом выделены результаты, максимально отличающиеся от остальных.
С целью выяснения причин завышения показателей вирусной нагрузки ВИЧ в тест-системах «АмплиСенс» образцы были протестированы в разведениях, близких к детекционному порогу тест-систем (табл. 4). Например, образец № 81 был протестирован в разведении 1:5. Исходя из значения, полученного в тест-системе «Cobas Amplicor», концентрация РНК в 5-кратном разведении должна быть менее 100 копий/мл, т.е. такой образец не должен быть детектирован в тест-системе «АмплиСенс», поскольку ее чувствительность не превышает 300 копий/мл. Тем не менее, для разведенного образца был получен результат 510 копий/мл.
Таблица 4.
№ образца |
Разведение |
Расчетная концентрация РНК (Cobas Amplicor) |
АмплиСенс FRT (копии РНК/мл) |
81 |
1:5 |
97 |
510 |
112 |
1:10 |
172 |
1 070 |
125 |
1:100 |
310 |
1 060 |
159 |
1:100 |
298 |
2 060 |
158 |
1:50 |
180 |
+ (420) |
С целью выяснения причины получения более низких результатов в тест-системе «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» был секвенирован фрагмент гена обратной транскриптазы для образцов №№ 75 и 154. Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что оба образца содержат ВИЧ субтипа В. Для образца № 154 не было выявлено достаточного количества мисметчей в местах посадки праймеров и зонда, которое могло бы повлиять на эффективность амплификации. Для образца № 75 было выявлено 2 мутации в месте посадки одного из праймеров, причем одна из них располагается непосредственно на 3`конце. Для эффективного выявления образца № 75 был выбран специальный праймер, который был включен в состав ПЦР-смеси (табл. 5).
Таким образом, состав ПЦР-смеси претерпел ряд изменений: изменилось соотношение праймеров в сторону повышения эффективности выявления ВИЧ субтипа G, были введены дополнительные праймер и зонд. Образцы, для которых были получены «заниженные» результаты в тест-системе «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT», были протестированы повторно с использованием модифицированной ПЦР-смеси в сравнении с тест-системой «CobasAmplicor». В результате повторного исследования были получены сопоставимые результаты в двух тестах (табл. 5).
Таблица 5.
№ образца |
Cobas Amplicor |
АмплиСенс FRT (М) |
82 |
867 |
715 |
164 |
3530 |
917 |
75 |
53900 |
29300 |
154 |
238 000 |
80600 |
Обсуждение
Для всех 3 тест-систем, участвовавших в данном исследовании, были получены результаты, которые хорошо коррелировали между собой. Наименьшее расхождение результатов было получено для тест-систем «АмплиСенс» (в 1 образце из 93 (1,1%) отличие между результатами составило 0,54 lg). Объясняется это тем фактом, что в обоих тестах используются одни и те же праймеры. Также высокая сходимость результатов (2 дискордантных образца из 93 – 2,2%) была получена для тест-систем «АмплиСенс ВИЧ Монитор» и «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5», что согласуется с более ранними данными по сравнительным испытаниям этих тестов [3, 4].
Наибольшее количество дискордантных результатов было обнаружено между тест-системами «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» и «Cobas AmplicorHIV-1 Monitorv. 1.5» (8 образцов из 93 – 8,6%). В 4 образцах из 8 наблюдалось завышение результатов в тест-системе «АмплиСенс» по сравнению с результатами, полученными в тест-системе «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5». При последующем тестировании этих образцов в разведениях, близких к детекционному порогу тест-систем, оказалось, что результаты вовсе не завышены. Скорее, наоборот, можно говорить о некотором занижении результатов с помощью тест-системы «Cobas Amplicor». С другой стороны, максимальное отличие между результатами не превышало 0,8 lg.
В 2 образцах из 8 дискордантных наблюдалось занижение результатов в тест-системе «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT». Кроме того, было выявлено 2 образца, в которых РНК не детектировалась с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT», в то время как в других тестах вирусная нагрузка была порядка 1000 копий/мл. Поскольку эти 4 пробы представляли для нас наибольший интерес, для них были секвенированы фрагменты гена обратной транскриптазы, в области которого располагаются места связывания праймеров и зондов, используемых в тест-системах «АмплиСенс». Для 2 проб из 4 были определены причины снижения эффективности амплификации: для пробы № 82 было обнаружено 4 мутации в месте посадки зонда, для пробы № 75 были выявлены мутации в одном из праймеров, одна из которых располагается на 3`конце. Полученные данные были использованы для дальнейшей оптимизации отечественных тестов, т.е. в ПЦР-смесь были введены дополнительные праймеры и зонды. Для двух других проб (№№ 164, 154) не было обнаружено достаточного количества мисметчей, которые бы вносили вклад в эффективность амплификации. Тем не менее, изменение соотношения праймеров в ПЦР-смеси привело к увеличению эффективности выявления этих двух образцов.
Заключение
В результате проведенного исследования были показана хорошая корреляция результатов вирусной нагрузки, полученных с использованием 3 тест-систем. В подавляющем большинстве случаев отличия между результатами не превышали 0,5 lg. Проведенное исследование позволило провести оптимизацию отечественных тестов, в результате которой повысилась эффективность выявления наиболее распространенных субтипов ВИЧ-1 в России.