Сравнительная оценка трех платформ для ПЦР в реальном времени

Сравнительная оценка трех платформ для ПЦР в реальном времени

Введение

Одним из наиболее информативных и удобных методов лабораторной диагностики является полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. Метод основан на том, что в процессе накопления продукта ПЦР происходит эквивалентное накопление сигнала флуоресценции. Это возможно благодаря встраиванию в двуцепочечные молекулы ДНК интеркалирующего красителя после чего последний способен к флуоресценции или благодаря присутствию в составе реакции специализированного специфичного флуоресцентного ДНК-зонда, изменяющего свою способность к флуоресценции при накоплении специфического продукта.

Уникальной особенностью данного метода является способность определять исходную  концентрацию ДНК мишени, анализируя кинетику накопления флуоресцентного сигнала в ходе реакции. Именно на данном свойстве метода основано, например, количественное определение различных микроорганизмов, исследования экспрессии генов и др. Во всех вариантах реализации количественной оценки происходит сравнение кинетики накопления сигнала в образце с неизвестным количеством ДНК мишени с кинетикой накопления сигнала в неких других образцах, обозначаемых как «стандартные», количество ДНК-мишени в которых известно (абсолютный количественный анализ) или принимается за точку отсчета (относительный количественный анализ).

Другими словами, для реализации количественной оценки мы вынуждены сравнивать один образец с другим, а, следовательно, мы должны быть уверены, что оба этих образца находятся в равных условиях. Это и создает особые требования к приборной базе для ПЦР в реальном времени: для всех пробирок, в которых проходит реакция должно соблюдаться температурное и оптическое единообразие.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось сравнение трех приборных баз для ПЦР в реальном времени: прибор «iQ5» (производства «BioRad», США), прибор «Mx3000P» (производства «Stratagene», США), прибор «Rotor Gene 6000» (производства Corbett Research, Австралия).

Для достижения температурного единообразия в приборе «Rotor Gene 6000» используется принцип термоциклирования в потоке воздуха. Вращаясь в нагретом или охлажденном воздухе, пробирки нагреваются и охлаждаются полностью эквивалентно и единообразно. Металлический блок Пелтье имеет определенную температурную инерционность и потому может нагреваться и охлаждаться не равномерно, быстрее у элементов Пелтье и медленнее с краев. При этом данная характеристика зависит от массы металла блока.

В приборе «Mx3000P» используется специализированный низко-инерционный блок малой массы, позволяющий сократить неоднородность, в приборе «iQ5» – обычный блок. Для достижения оптического единообразия в приборе «Rotor Gene 6000» реализован принцип единого источника, детектора и оптического пути. Вращаясь, все пробирки последовательно проходят через луч света от единого источника излучения, а сигнал флуоресценции попадает в единый детектор. При этом детекция сигнала со всех пробирок блока осуществляется за 0,2 секунды. В приборе «Mx3000P» так же реализован принцип единого источника, детектора и оптического пути, но за счет подвижной считывающей головки, к которой подходят и от которой отходят световоды от источника и к детектору. Цикл измерения всей плашки образцов совершается за 3 секунды.

В приборе «iQ5» физически единый оптический путь отсутствует, однако существует математическая компенсация, а так же 4 вида регулярных калибровок, призванных нивелировать эффект оптической неоднородности.

Материалы и методы

В качестве тест-системы для проведения исследования был использован набор реагентов “CMV-Monitor-FRT” (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), адаптированный производителем для использования с тремя платформами «iQ5», «Mx3000P», «Rotor Gene 6000». Методика сравнения включала в себя параллельную амплификацию контрольного образца ДНК CMV c концентрациями 1000000, 100000, 10000, 1000 и 100 копий/мл (в реакцию вносилось 25 мкл образца) на трех платформах. Все реагенты смешивались и вносились в пробирки одновременно.

Для сравнения была использована величина порогового цикла (Ct) - цикл начала увеличения флуоресценции, на котором сигнал уже достоверно отличим от приборного шума, но при этом еще наблюдается экспоненциальный рост сигнала, данная величина прямо пропорциональна логарифму исходной концентрации ДНК-мишени. Расчет базовой линии (за несколькими исключениями для прибора «iQ5») проводился автоматически. Линия порога выставлялась по логарифмической шкале таким образом, чтобы ее уровень примерно соответствовал середине участка линейного накопления логарифма сигнала (середина фазы экспоненциального роста).

Результаты

Сравнение по чувствительности

Проводилось с использованием контрольного образца CMV с концентрацией 100 копий/мл (2-3 копии в реакцию), для которой положительный результат ПЦР может быть не воспроизводим. Оценку проводили по соотношению положительных и отрицательных результатов амплификации из 10 повторов. В результате положительный результат показали для прибора «iQ5» 8 точек из 10, «Mx3000P» – 7 из 10, прибора «Rotor Gene» – 7 точек из 10. Таким образом, чувствительность трех приборов при качественном выявлении ДНК оказалась практически равной, что так же указывает на то, что адаптация использованной нами для исследования тест-системы к трем приборам проведена верно.

Сравнение по разбросу

После проведения реакции амплификации был произведен расчет значений пороговых циклов. Для идентичных точек было рассчитано стандартное отклонение величины порогового цикла, а так же разность между максимальным и минимальным значениями:

	Концентрация копий/мл	N	«iQ5» («BioRad»)		«Mx3000P» («Stratagene»)		«Rotor Gene 6000» («Corbett research»)
			Ст.отклон Ct	Max(Ct) – Min(Ct)	Ст.отклон Ct	Max(Ct) – Min(Ct)	Ст.отклон Ct	Max(Ct) – Min(Ct)
1	1 000 000	5	0.34	0.89	0.20	0.47	0.04	0.11
2	100 000	5	0.42	0.97	0.06	0.13	0.03	0.06
3	10 000	7	0.17	0.45	0.10	0.27	0.07	0.16
4	1000	9	0.93	2.32	0.58	1.31	0.61	1.28

Из данных по разбросу видно, что лучший результат показал прибор «Rotor Gene 6000», прочти идентично с ним сработал прибор «Mx3000P», худший результат показал прибор «iQ5». Разброс по значениям пороговых циклов для «iQ5» превышал таковой для приборов «Mx3000P» и «Rotor Gene 6000» в 2-3 раза. Учитывая то, что величина порогового цикла участвует в расчете концентраций образцов, прибор «iQ5» дает менее точный результат количественной оценки. Отличие в 1 цикл соответствует двукратной разнице концентрации, таким образом, только за счет  погрешности измерения прибора средняя ошибка измерения концентрации для точек более 10000 копий/мл будет: для прибора «iQ5»:  ±0,12lg, «Mx3000P»:  ±0,05lg, «Rotor Gene 6000»:  ±0,02lg.

Заключение

Полученные данные указывают на то, что конструктивное решение прибора может оказывать влияние на качество получаемых результатов. Приборы, при разработке которых особое внимание уделялось единообразию температуры и оптического пути для всех образцов («Mx3000P», «Rotor Gene 6000») способны показывать более точные результаты количественных измерений, чем приборы, где конструктивно подобное единообразие не предусматривается («iQ5»). Так же стоит учесть, что, будучи умноженными на другие потенциальные источники ошибки (ошибки концентрации стандартов, вариация в реагентах, субъективные ошибки и др.), данные различия могут привести к значительным отклонениям в результатах измерений и критично сказаться на результатах мониторинга вирусной нагрузки, экспрессии генов и других параметров.