Пиросеквенирование: сочетание секвенирования и количественного анализа

Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза».  Метод «секвенирования путем синтеза» позволяет секвенировать одну цепь ДНК путем синтеза комплементарной цепи, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. В ходе реакции матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после каждого цикла секвенирования.

Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Последовательность подачи реагентов в реакционную смесь, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность анализируемого участка ДНК.

Последовательность реакций пиросеквенирования

В реакции пиросеквенирования участвуют четыре фермента. Схема и основные этапы реакции представлены на рис. 1. 

    Рисунок 1. Схема реакции пиросеквенирования.

Пиросеквенирование включает в себя следующие этапы:

Этап 1

Амплификация фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей для пиросеквенирования. Денатурация биотинилированного одноцепочечного ПЦР-ампликона, его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования.

Этап 2

Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5’- фосфосульфата (APS) и люциферина.

Этап 3

Добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов.

Этап 4

АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’-фосфосульфата. Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу.

Этап 5

В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид.

Этап 6

Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. Следует отметить, что дезоксиаденозин-альфа-тио-фосфат используется в роли заместителя дезоксиаденозин-3-фосфата (дАТФ), так как он эффективно распознается ДНК-полимеразой, но не распознается люциферазой. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме.

Области применения пиросеквенирования

Генетическое тестирование

• Генетическая паспортизация и выявление генетических полиморфизмов, ассоциированных с развитием мультифакториальных заболеваний.
• Генетический анализ «сложных» областей генома (транслокации, повторы, делеции).
• Верификация и валидация результатов полногеномного анализа.

Онкология

• Выявление активирующих соматических мутаций в генах EGFR, RAS, BRAF, PI3K и др.
• Анализ метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: MGMT, MLH1, p16 и др.
• Поиск новых генетических маркеров злокачественных новообразований.

Микробиология и генная инженерия

• Генотипирование штаммов.
• Ресеквенирование генов: обнаружение новых генетических вариантов, островков патогенности, вирулентности и т.д.
• Идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость вирусов к антиретровирусной терапии.
• Идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость бактерий и грибов к антибиотикам.
• Проверка результатов клонирования: секвенирование ПЦР-ампликонов, плазмид, ДНК-кассет.
• Разработка уникальных ПЦР тест-систем.

Список использованной литературы

1. К.О. Миронов, Е.А. Дунаева, О.П. Дрибноходова, В.Г. Дедков, Г.А. Шипулин. Детекция генетических полиморфизмов с использованием системы генетического анализа на основе пиросеквенирования PyroMark Q24 // Справочник заведующего КДЛ. 2011. N 4. С. 39-48

2. К.О. Миронов, Е.А. Дунаева, О.П. Дрибноходова, Г.А. Шипулин. Детекция генетических полиморфизмов с помощью систем генетического анализа на основе пиросеквенирования // Современные медицинские технологии. 2011. С. 39-41

3. Dunker J., Larsson U., Petersson D. et al. Parallel DNA template preparation using a vacuum filtration sample transfer device // Biotechniques. 2003. Vol. 34, N 4. P. 862–866, 868.

4. King C.R., Scott-Horton T. Pyrosequencing: a simple method for accurate genotyping // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 373. P. 39–56.

5. Ronaghi M., Uhlen M., Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate // Science. 1998. Vol. 17, N 281 (5375). P. 363–365.

6. Royo J.L., Galan J.J. Pyrosequencing for SNP genotyping // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 578. P. 123–133.

7. Tsiatis A.C., Norris-Kirby A., Rich R.G. et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications // J. Mol. Diagn. 2010. Vol. 12, N 4. P. 425–432.