Разработка тест-системы для одновременного выявления РНК ВИЧ и вируса гепатита С (HCV) и ДНК вируса гепатита В (HBV) в образцах донорской крови

Разработка тест-системы для одновременного выявления РНК ВИЧ и вируса гепатита С (HCV) и ДНК вируса гепатита В (HBV) в образцах донорской крови

Проблема вирусной безопасности препаратов донорской крови приобретает особую актуальность в связи с эпидемической ситуацией, сложившейся в отношении вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции. Использование серологических тестов для скрининга препаратов крови позволило существенно снизить риск передачи этих инфекций при трансфузиях. Однако от момента инфицирования до появления антител к вирусу может проходить значительный период, известный как «серологическое окно». В данной ситуации большую помощь могут оказать тесты, позволяющие выявлять сам вирус или его компоненты. Использование молекулярно-генетических методов диагностики позволило сократить период «серологического окна» и повысить безопасность трансфузий. В США и странах Западной Европы широкое распространение получили тест-системы «Procleix» фирмы Gene Probe, «UltraQual» Национального Института Генетики, «AmpliScreen» фирмы Хоффманн-Ля Рош.

В России зарегистрирована только тест-система «AmpliScreen», однако в службу донорской крови внедрена не была по ряду причин (высокая стоимость исследования, низкая пропускная способность, необходимость в дорогостоящем оборудовании). Одним из существенных недостатков тест-системы «AmpliScreen» является необходимость тестирования каждой инфекции отдельно, что значительно усложняет и удорожает стоимость анализа. В связи с этим стала актуальной разработка дешевого высокочувствительного теста, позволяющего одновременно выявлять ВИЧ и вирусы гепатитов В и С.

Для увеличения пропускной способности станций переливания крови при проведении молекулярно-генетических исследований используется технология пулирования, т.е. объединение нескольких индивидуальных образцов в один мини-пул, что в свою очередь приводит к снижению чувствительности выявления инфекционного образца. С этим связано основное требование к тест-системам, предназначенным для скрининга донорской крови – максимально высокая аналитическая чувствительность.

Существует несколько подходов для повышения чувствительности теста: ультрацентрифугирование большого объема плазмы (например, 1 мл) или использование автоматических станций, позволяющих выполнять экстракцию нуклеиновых кислот (НК) из больших объемов клинического материала. Так, метод ультрацентрифугирования используется в тест-системах «AmpliScreen», однако такой подход позволяет повысить чувствительность выявления в 10 раз только для ВИЧ. Для других вирусов метод ультрацентрифугирования увеличивает чувствительность теста не более чем в 2-3 раза.

Из автоматических станций интерес представляет прибор easyMAG (BioMerieux, Франция), недавно появившийся на Российском рынке и успевший зарекомендовать себя как универсальный экстрактор нуклеиновых кислот. Особенностью данного прибора является возможность экстракции НК из 1 мл плазмы крови.

Цель

Целью работы было создание ПЦР-тест-системы для одновременного выявления РНК ВИЧ, HCV и ДНК HBV, которая будет обладать высокой чувствительностью и высокой пропускной способностью.

Материалы и методы

Тест-система, разработанная для одновременного выявления нуклеиновых кислот ВИЧ, HCV и HBV, предполагает экстракцию РНК/ДНК из индивидуальных образцов (объемом 100-1000мкл) либо из мини-пулов (объемом 1000 мкл). Выделение РНК/ДНК из индивидуальных образцов может осуществляться 2 способами: вручную либо с помощью автоматической станции easyMAG. При тестировании мини-пулов рекомендуется выделение РНК/ДНК проводить из пула объемом 1000 мкл с использованием автоматической станции easyMAG. Для этого мини-пул формируют таким образом, чтобы он состоял не более чем из 10 индивидуальных образцов, которые скапывают по 100 мкл. Для экстракции НК «вручную» может быть использован метод сорбции НК на силикагеле (набор «Рибо-сорб») или метод осаждения с использованием изопропанола (набор «Рибо-преп»). В основе автоматической экстракции лежит метод сорбции НК на магнитной силике.

Выделенная РНК/ДНК добавляется в 2 пробирки, содержащие реакционный буфер для проведения ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией. Для детекции продуктов амплификации используется технология TaqMan, поэтому для амплификации используется прибор для проведения Real-Time ПЦР (например, Rotor Gene фирмы Corbett Research). В первой пробирке проводится амплификация и детекция РНК ВИЧ и внутреннего контроля, во второй пробирке проводится амплификация и детекция РНК HCV, ДНК HBV и внутреннего контроля. ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией, в обеих пробирках идет в одном реакционном модуле по одной программе. Поскольку в ходе анализа тестируется одновременно 5 мишеней (ВИЧ, HCV, HBV, ВКО ВИЧ, ВКО HСV), прибор для Real-Time ПЦР должен иметь не менее 4 каналов детекции флуоресцентного сигнала (Fam, Joe/Hex, Rox, Cy5.5 или Cy5).

Для определения аналитической чувствительности тест-системы были использованы СОП РНК ВИЧ, ОСО РНК HCV и ОСО ДНК HBV. Из препаратов СОП ВИЧ-1, ОСО ДНК HBV и ОСО РНК HCV готовили модельные образцы путем двукратных и десятикратных разведений, используя плазму крови от здоровых доноров.

Результаты

Для определения аналитической чувствительности и ингибирующего влияния сопутствующих инфекций был проведен ряд экспериментов на модельных образцах, содержащих все три инфекционных агента в разной концентрации (табл. 1 и 2). В таблице 1 представлены результаты, полученные при тестировании 100 мкл образца с использованием набора «Рибо-сорб», в таблице 2 представлены результаты, полученные при тестировании 1000 мкл образца на приборе easyMAG.

Таблица 1. Аналитическая чувствительность тест-системы на модельных образцах, содержащих НК HCV, ВИЧ и HBV.

Концентрация препарата			Результат-ВИЧ	Результат-HCV	Результат-HBV
ВГС (МЕ/мл)	ВИЧ (копий/мл)	HBV (копий/мл)
100	10*5	10*6	+	+	+
10*6	10*5	100	+	+	+
10*6	500	10*6	+	+	+

Таблица 2. Аналитическая чувствительность тест-системы на модельных образцах, содержащих НК HCV, ВИЧ и HBV.

Концентрация препарата			Результат-ВИЧ	Результат-HCV	Результат-HBV
ВГС (МЕ/мл)	ВИЧ (копий/мл)	HBV (копий/мл)
100	10*5	10*6	+	+	+
10*6	10*5	20	+	+	+
10*6	50	10*6	+	+	+

Обсуждение

Для использования молекулярных методов диагностики в службе донорской крови с целью повышения вирусной безопасности должны быть разработаны тест-системы, обладающие высокой чувствительностью и высокой пропускной способностью. Наиболее перспективными будут методики, позволяющие проводить исследования в автоматическом режиме, тем самым, сведя к минимуму частоту лабораторных ошибок. Кроме того, автоматизация позволит сократить время анализа и увеличить пропускную способность лаборатории. В последние годы был сделан огромный шаг в области автоматизации ПЦР-исследований с внедрением метода Real-Time ПЦР, позволяющего проводить амплификацию и детекцию продуктов в автоматическом режиме.

В связи с этим нами была предпринята попытка разработать тест-систему на основе метода Real-Time ПЦР для одновременного выявления нуклеиновых кислот ВИЧ и вирусов гепатита В и С. Также нами предложен вариант автоматической пробоподготовки с использованием прибора easyMag, позволяющего не только ускорить процедуру экстракции нуклеиновых кислот, но и значительно повысить чувствительность анализа за счет возможности тестирования большого объема клинического материала. Использование данного прибора позволит проводить тестирование мини-пулов практически без снижения чувствительности выявления инфекционного материала.

Время экстракции нуклеиновых кислот в автоматическом режиме с использованием прибора easyMag составляет менее 60 минут для 24 образцов. Реакция обратной транскрипции и амплификация в режиме реального времени занимает менее 3 часов. Таким образом, имея 1 прибор для пробоподготовки и 1 прибор для проведения Real-Time ПЦР, можно протестировать 24 индивидуальных образца или 24 мини-пула (из 10 образцов) за 4 часа. За 1 рабочий день можно осуществить 2 независимые постановки, увеличив производительность лаборатории до 48 индивидуальных образцов или мини-пулов.

Заключение

На базе ФГУН ЦНИИЭ разработана тест-система на основе метода Real-Time ПЦР, позволяющая одновременно выявлять нуклеиновые кислоты ВИЧ, HCV и HBV с чувствительностью 50 копий РНК/мл (для ВИЧ), 10 МЕ/мл (для HCV) и 20 копий ДНК/мл (для HBV). Предложенный формат имеет низкую себестоимость и высокую пропускную способность.