Использование методов молекулярной эпидемиологии при проведении эпидемиологического надзора над легионеллёзами

Использование методов молекулярной эпидемиологии при проведении эпидемиологического надзора над легионеллёзами

Введение

Представители рода Legionella широко распространены в природе. Около 20 видов способны вызывать заболевания людей, при этом 70-90 %  случаев пневмоний, вызванных легионеллами, (или болезнь Легионеров) спорадического или вспышечного характера развивается вследствие ингаляции или аспирации водного аэрозоля, контаминированного Legionella pneumophila I серогруппы, однако серьёзную опасность могут представлять также L.pneumophila других серогрупп.

Эпидемиологический надзор за легионеллезом затруднен вследствие отсутствия эффективных методов обнаружения возбудителя в клиническом материале и объектах окружающей среды, поэтому данные о распространении этой инфекции в России и странах СНГ практически отсутствуют. Бактериологическое исследование длительно, трудоемко и обладает невысокой чувствительностью. С помощью иммуноферментного анализа возможно выявление антител только к Legionella pneumophila  1 серогруппы. Серологические методы диагностики легионеллеза являются по своей сути ретроспективными.

Цели и задачи

С целью оптимизации эпидемиологического надзора в ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора совместно с Российским научно-исследовательским противочумным институтом «Микроб» разработана тест-система на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, позволяющая обнаруживать ДНК L.pneumophila в образцах из нижних дыхательных путей больных и окружающей среды, а также оценивать количество микроорганизмов в воде. В задачи исследования входила апробация разработанной тест-системы на клиническом материале и объектах окружающей среды.

Материалы и методы

В качестве мишени для обнаружения всех серогрупп L.pneumophila и L. micdadei, второго по частоте вида, имеющего эпидемическую значимость,  выбран участок гена mip. В анализе использовался экзогенный и эндогенный образцы внутреннего контроля, которые позволяют контролировать качество анализа при тестировании и проводить учет потерь ДНК, что отражает реальную концентрацию ДНК L.pneumophila в каждом исследуемом образце воды. Структура олигонуклеотидных зондов, конъюгированных с флуоресцентными красителями позволяла проводить детекцию флуоресценции как во время ПЦР на приборе Rotor Gene, так и после окончания реакции на приборе Ala-1 «Биосан», Латвия. При выполнении расчетов учитывалась степень концентрирования воды.

В работе использованы штаммы: бактерии рода Legionella (L. pneumophila Philadelphia 1 ATCC 33152, L. pneumophila Togus ATCC 33154, L. pneumophila Bloomington ATCC 33155, L. dumoffii Tex-KL, L. longbeachae); 78 культур микроорганизмов из родов Bacillus, Citrobacter, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Klebsiella, Listeria, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Yersinia.

Клинический материал: кровь (50 образцов) и мазки со слизистых носоглотки и ротоглотки (55 образцов), бронхоальвеолярный лаваж (1 образец), моча (30 образцов) от практически здоровых индивидов; мокрота от пациентов (16 - 87 лет), госпитализированных в клиники г. Смоленска с диагнозом внебольничная пневмония (200 образцов); материал от 133 человек, собранный во время вспышки легионеллёза в г. Верхняя Пышма (всего 230 образцов): 109 ротоглоточных смывов, 2 образца мокроты, 2 образца бронхо-альвеолярного лаважа, 51 образец плазмы крови, 63 образца сыворотки крови, 8 образцов мочи; 10 образцов секционного материала (суспензии легких и селезенки) от 4 умерших пациентов. Образцы окружающей среды: 81 проба (водопроводная вода горячая и холодная, вода из колодцев, фонтанов и открытых водоёмов, вода техническая из градирни, смывы с внутренних поверхностей труб и душевых насадок).

Постановка реакции ПЦР осуществлялась по инструкции к тест-системе «АмплиСенс Legionella pneumophila-Fl» с детекцией в режиме реального времени на приборах RotorGene 3000 или 6000 (Corbett Research, Австралия) или на амплификаторах «GeneAmp 2700» (Applied Biosystems, USA) с детекцией после окончания ПЦР на приборе Aal-1 (Биосан).

Секвенирование фрагментов амплификации выполняли на базе ФГУН ЦНИИЭ методом “cycle sequence” с набором ABI PRISM Big Dye v.1.1 (Applied Biosystems, USA), согласно инструкции изготовителя при использовании автоматического анализатора ABI-3100 PRISM (Applied Biosystems, США).

Результаты

Оценка аналитических характеристик тест-системы с использованием культур микроорганизмов проводилась на базе Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»). Чувствительность анализа при тестировании культур  L. pneumophila составила 100 микробных клеток в 1 мл тестируемой бактериальной суспензии. При тестировании искусственно инфицированного биологического материала чувствительность анализа составила 1000 микробных клеток в 1 мл пробы материала. Положительный сигнал был зафиксирован только при анализе проб, содержащих  L. pneumophila. При тестировании микроорганизмов других родов (78 штаммов) и видов рода Legionella (L. dumoffii Tex-KL, L. longbeachae), а также клинического материала от здоровых людей (136 образцов) во всех случаях отмечен отрицательный результат, следовательно, специфичность анализа составила 100%.

Для оценки аналитических характеристик количественного анализа проведены эксперименты по определению линейного диапазона измерения, предела детекции, предела количественного измерения с использованием количественно охарактеризованных препаратов рекомбинантных плазмид. Предел детекции составил 1-5 копий ДНК в реакцию (100-500 копий ДНК/мл), предел количественного измерения составил 10 копий ДНК в реакцию (1000 копий ДНК/мл). Воспроизводимость количественного анализа оценивалась в эксперименте на образцах фильтратов воды из г. Верхняя Пышма, при этом расчётное количество ДНК варьировало с коэффициентом вариаций 21%.

Тест-система была апробирована (на базе Государственной Смоленской медицинской академии) на 200 образцах мокроты от пациентов, госпитализированных в клиники г. Смоленска с сентября 2006 года по апрель 2007 года с диагнозом внебольничная пневмония. Одновременно этот же материал был исследован с помощью стандартного бактериологического анализа. Положительный ответ в ПЦР зафиксирован в двух пробах (1,0 %), тогда как выделить культуру L. pneumophila ни в одном случае не удалось. Для верификации результатов ПЦР-анализа было проведено секвенирование полученных фрагментов амплификации. Установлено полное соответствие нуклеотидной последовательности ПЦР-продуктов фрагменту гена mip L. pneumophila, фланкированному использованными в тест-системе праймерами.
 
Разработанная тест-система была использована при расследовании вспышки внебольничной пневмонии в г. Верхняя Пышма в июле 2007 года. Тестированию подвергся как клинический материал (секционный материал, мокрота, сыворотка крови, моча), так и образцы внешней среды.
При исследовании материала со вспышки ДНК L.pneumophila обнаружена в секционном материале от 4 умерших (в 4-х фрагментах лёгких и одном образце селезёнки), в одном из двух тестированных образцов свободно-отходящей мокроты и в одном из двух образцов БАЛ. При этом положительный образец БАЛ был получен от впоследствии умершего пациента и исследованный секционный материал также содержал ДНК L.pneumophila. Методом ПЦР в одном из 8 образцов мочи была обнаружена ДНК L.pneumophila. Образцы секционного материала от трёх умерших и те же 8 образцов мочи были исследованы в лаборатории легионеллёзов научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН. Из одного образца легочной ткани была выделена культура L.pneumophila I серогруппы, в 7-ми образах мочи был обнаружен  фильтрующийся антиген полисахаридной природы специфичный для L.pneumophila I серогруппы (Binax).

С помощью ПЦР было протестировано 109 мазков из ротоглотки, из них в трёх была обнаружена ДНК L.pneumophila. Мазки с задней стенки глотки, в которых была обнаружена ДНК возбудителя, получены на 2-9 день заболевания от двух пациентов с тяжелым течением заболевания и одного пациента с заболеванием средней тяжести. У одного из этих пациентов с тяжелым течением заболевания ДНК L.pneumophila была обнаружена также в сыворотке крови. В остальных 51 образцах плазмы крови и 62 образцах сыворотки крови ДНК L.pneumophila не была обнаружена. Надо отметить, что легионелла, является внутриклеточным патогеном, локализующимся в макрофагах лёгочной ткани, поэтому такой клинический ма-териал, как мазки из верхних дыхательных путей, моча и кровь не является оптимальным для исследования.

Для проведения как бактериологического, так ПЦР исследования необходимо получение БАЛ или индуцированной мокроты, так как мокрота самостоятельно отходит у больных легионеллёзной пневмонией менее чем в 50 % случаев. ДНК возбудителя может быть обнаружена в мазках с задней стенки глотки, моче и  плазме крови пациентов, но в незначительном проценте случаев. В связи с этим, исследование данного материала показано только при невозможности получения мокроты, аспирата и БАЛ, при этом отрицательный результат исследования данного материала нельзя считать окончательным. Если же ДНК L.pneumophila  обнаружена в мазках с задней стенки глотки, моче и  плазме крови пациентов, положительный результат можно считать окончательным, так как тест обладает специфичностью 100% и более чувствителен, чем бактериологическое исследование.  Полученные данные показывают, что диагностическую чувствительность ПЦР-анализа можно увеличить, если собирать клинический материал в наиболее ранние сроки после начала болезни (до начала терапии антибиотиками); при этом ДНК преимущественно обнаруживается в крови и моче у пациентов с более тяжёлым течением болезни.

При исследовании объектов окружающей среды, собранных эпидемиологами в различных местах города Верхняя Пышма, ДНК L.pneumophila была обнаружена в 15 из 81 проб. Секвенирование фрагментов амплификации выявило полное соответствие его нуклеотидной последовательности фрагменту гена mip L. pneumophila.

Положительные образцы включали пробы технической воды из градирни (4) и воду разводящей сети с территории завода ОАО "Уралэлектромедь"(2); пробы горячей воды из теплопунктов (6) и разводящей сети (3). Кроме того, ДНК L.pneumophila выявлена в 3 из 22 смывов с душевых насадок, взятых в квартирах людей, проживающих в городе Верхняя Пышма и госпитализированных с диагнозом пневмония неуточненная. В лаборатории легионеллёзов научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН была выделена культура L.pneumophila 1 серогруппы из одного смыва с поверхности дренажного канала теплопункта.

Дальнейшее детальное молекулярно-эпидемиологическое расследование проводилось с использованием генотипирования ДНК L.pneumophila методом мультилокусного секвенирования по методике экспертной Европейской рабочей группы (EWGLI, http://www.ewgli.org). Проведённое исследование показало идентичность по 5 генам ДНК L.pneumophila, обнаруженной в секционном материале и в горячей воде тепло-пункта жилого дома, что подтвердило аспирационный путь передачи инфекции через горячую воду, контаминированную возбудителем. L.pneumophila. Обнаруженные в технической воде из градирни, в смыве из душевой головки в квартире заболевшего и в смыве из дренажного канала теплопункта L.pneumophila принадлежали к другим аллельным вариантам и, следовательно, не были связаны с эпизодом вспышки.

Заключение

Разработана тест-система для обнаружения всех серогрупп L. pneumophila и L. micdadei. Результаты апробации дали высокую оценку аналитическим характеристикам тест-системы, показана хооршая воспроизводимость количественного анализа.

Использование ПЦР-анализа позволило определить частоту внебольничных пневмоний, вызванных L.pneumophila в Смоленске, которая составила 1%.

Представленные в данной работе исследования показали результативность использования разработанной тест-системы для тестирования объектов окружающей среды с целью мониторинга, выяснения источников заражения людей L.pneumophila при проведении эпидемиологического расследования и подтверждения диагноза при исследовании материала из нижних дыхательных путей или секционного материала в случае смертельного исхода.

Применение ПЦР-анализа способствовало быстрому проведению эпидемиологического расследования вспышки в г. Верхняя Пышма. ДНК L.pneumophila не была обнаружена системе снабжения города питьевой водой и в воде главного городского фонтана, что позволило быстро исключить два из предполагаемых путей передачи, в то же время обнаружение ДНК L.pneumophila в системе горячего водоснабжения подтвердило высказанную ранее версию и позволило своевременно провести противоэпидемические мероприятия.

Полученные данные позволяют предполагать, что использование разработанной тест-системы для мониторинга объектов водоснабжения, кондиционирования воздуха и медицинского оборудования позволит повысить эффективность надзора над заболеваниями, вызванными L.pneumophila.