Результаты испытаний прибора для ПЦР с детекцией в режиме реального времени «Rotor-Gene» модель 6000.

Результаты испытаний прибора для ПЦР с детекцией в режиме реального времени «Rotor-Gene» модель 6000.

Введение.

Метод ПЦР с детекцией в режиме реального времени (Real-time PCR) постепенно находит все более широкое применение в практике лабораторной диагностики и, прежде всего, в молекулярной диагностике инфекционных заболеваний.

Среди приборов для ПЦР с детекцией в режиме реального времени, имеющихся на российском рынке, в настоящее время достаточно широкое применение получил прибор «Rotor-Gene 3000» производства компании «Corbett Research Pty Ltd.», зарегистрированный МЗ РФ (регистрационное удостоверение № 2004/278). Этот прибор успешно прошел испытания на базе ЦНИИ Эпидемиологии и был рекомендован для использования в лабораторной диагностике благодаря высоким техническим характеристикам, качеству результатов и удобству эксплуатации. В январе 2006 года компания «Corbett Research Pty Ltd.» приступила к выпуску новой модели прибора «Rotor-Gene» – модели «6000».

В новой модели прибора «Rotor-Gene», также как и в модели «3000», реализовано конструктивное решение, ключевыми элементами которого являются роторный формат реакционного блока, термоциклирование в потоке циркулирующего воздуха и детекция флуоресцентного сигнала с помощью набора светодиодов и фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Такое конструктивное решение обеспечивает

- максимальную точность и воспроизводимость результатов детекции флуоресцентного сигнала за счет идентичных условий детекции для всех пробирок в модуле (идентичной длины оптического пути), и

- максимально идентичный температурный режим во всех пробирках (отсутствие краевых эффектов).

Эти два преимущества в сочетании с точными и гибкими алгоритмами обработки данных программным обеспечением прибора определяют высокое качество результатов ПЦР-анализа при его использовании

Основными преимуществами новой модели прибора «Rotor-Gene» по сравнению с имеющимися на сегодня аналогами являются следующие возможности:

- во-первых, новая модель 6000 предоставляет возможность использования 5-6 каналов флуоресцентной детекции, что позволяет проводить мультиплексный ПЦР-анализ для выявления и дифференциации 5-6 различных ДНК-мишеней с помощью одной ПЦР-реакции;

- во-вторых, следует отметить наличие полностью русифицированного интерфейса программного обеспечения данной модели прибора, что, несомненно, сделает гораздо более удобной работу с ним для широкого круга пользователей. Русскоязычный интерфейс программы является уникальной особенностью прибора «Rotor-Gene» модель 6000 по сравнению со всеми аналогами зарубежного производства;

- в третьих, новая модель прибора имеет дополнительные функциональные возможности, позволяющие выполнять исследования новым перспективным методом – ПЦР с анализом кривых плавления с высоким разрешением (HRM-анализ, High Resolution Melt). Для реализации этого метода в данном приборе достигается разрешение по температуре до 0,02°С.

 
Целью данной работы являлось изучение функциональных возможностей прибора «Rotor-Gene 6000» при работе в условиях диагностической лаборатории.

Материалы и методы.

Для тестирования использовали ПЦР тест-систему для выявления PНК вируса гриппа типа А методом обратной транскрипции и ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс^Ò Influenza virus H5», зарегистрированнную МЗ РФ. Тестирование проводилось в соответствии с инструкцией к данной ПЦР тест-системе. Использовали 60 образцов мазков со слизистых оболочек полости носа и ротоглотки а также панель из 10 контрольных образцов, содержащих РНК вируса гриппа А в концентрации, соответствующей пределу аналитической чувствительности используемой тест-системы.

Проводили также тестирование с использованием тест-системы «АмплиСенс^Ò CMV-Монитор-FRT», предназначенной для количественного определения содержания ДНК цитомегаловируса человека в плазме крови, в соответствии с инструкцией к данной ПЦР тест-системе. Использовали панель контрольных образцов с известными концентрациями ДНК CMV.

Для дальнейшего изучения функциональных возможностей прибора проводили тестирование с использованием разрабатываемой в настоящее время тест-системы для выявления и дифференциации в формате мультиплексной ПЦР 4 различных микроорганизмов, вызывающих ИППП: Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma sp. иMycoplasma hominis. Для проведения этого теста требуется использование 5 каналов флуоресцентной детекции, соответствующих спектральным характеристикам флуорофоров FAM, JOE, ROX, Cy5 и Cy5.5.

 
Результаты и обсуждение.

В ходе проведения испытаний прибора «Rotor-Gene 6000» с использованием тест-системы «АмплиСенс ^Ò Influenza virus H5» для обнаружения РНК вируса гриппа типа А было проанализировано 60 образцов клинического материала (мазки со слизистых оболочек полости носа и ротоглотки), из них 20 образцов содержащих РНК вируса гриппа А. Качественные результаты анализа, проведенного при использовании прибора «Rotor-Gene» модель 6000, полностью совпадали с результатами, полученными при анализе с использованием прибора «Rotor Gene 3000».

В процессе испытаний проводилось также тестирование панели из 10 контрольных образцов, содержащих РНК вируса гриппа А в концентрации, соответствующей пределу аналитической чувствительности данной тест-системы. Тестирование каждого образца проводилось дважды на обоих приборах. Для всех указанных образцов был получен положительный результат в двух повторах теста при анализе, проведенном с использованием прибора «Rotor-Gene 6000», также как и при использовании прибора «Rotor Gene 3000». Значения показателя «пороговый цикл» («Ct»), полученные при использовании прибора «Rotor-Gene 6000» соответствовали значениям, полученным при использовании прибора «Rotor Gene 3000», или несколько опережали их (на 0,5-0,7 Ct), для всех контрольных образцов.

Таким образом, при использовании прибора «Rotor-Gene 6000», создаваемые данным прибором режимы амплификации и детекции обеспечивали равные показатели аналитической чувствительности по сравнению с показателями, полученными при использовании прибора «Rotor Gene 3000».

При анализе результатов тестирования отмечено, что показатели детектируемого изменения специфического флуоресцентного сигнала (значения «Ct» и максимальный уровень флуоресценции) при использовании прибора «Rotor-Gene 6000» полностью соответствовали показателям, полученным при использовании прибора «Rotor Gene 3000», и полученные данные не вызывали никаких затруднений при интерпретации результатов.

Далее тестирование функциональных возможностей прибора «Rotor-Gene 6000» проводили с использованием количественной тест-системы «АмплиСенс CMV-Монитор», предназначенной для определения концентрации ДНК цитомегаловируса в плазме крови. Анализировали панель из 10 контрольных образцов плазмы, содержащих ДНК CMV в различных концентрациях: по 2 образца с концентрациями 10⁵, 10⁴, 10³,  500 и 0 ГЭ/мл. После выделения ДНК из образцов контрольной панели (2 повтора для каждого образца) из каждого образца очищенной ДНК отбирали одинаковые аликвоты для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени одновременно с использованием двух приборов - «Rotor-Gene 6000» и «Rotor-Gene 3000». Результаты определения концентрации ДНК-мишени с помощью прибора «Rotor-Gene 6000» для всех тестируемых образцов соответствовали заданным концентрациям (ранее определенным для этих образцов панели). Коэффициент вариации при определении концентрации ДНК CMV для образцов с концентрациями 10³ -10⁵ ГЭ/мл не превышал 10%, и для образцов с концентрацией 500 ГЭ/мл CV не превышал 18%. Коэффициент корреляции R по графику стандартов (Standard Curve) составлял не менее 0,99, а показатель эффективности реакции E – не менее 0,95, что соответствует показателям получаемым при использовании прибора «Rotor-Gene 3000».

Таким образом, при использовании прибора «Rotor-Gene 6000» обеспечиваемые им режим термоциклирования, детекция флуоресцентного сигнала и обработка данных обеспечивали получение точных результатов количественного ПЦР-анализа в диапазоне концентраций ДНК-мишени, соответствующем линейному диапазону используемой тест-системы.

В процессе проведения 20 полных запусков прибора в ходе испытаний и при дальнейшей работе не было зафиксировано сбоев или ошибок при выполнении программы анализа.

Для дальнейшего изучения функциональных возможностей прибора проводилось тестирование с использованием мультиплексных тест-систем, разработанных в ЦНИИ Эпидемиологии, в частности, с использованием разрабатываемой в настоящее время тест-системы для выявления и дифференциации в формате мультиплексной ПЦР 4 различных микроорганизмов, вызывающих ИППП: Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma sp. иMycoplasma hominis (Мультиплекс-уро-4). Для проведения этого теста требуется использование 5 каналов флуоресцентной детекции, соответствующих спектральным характеристикам флуорофоров FAM, JOE, ROX, Cy5 и Cy5.5. Для детекции ДНК Chlamydia trachomatis используется зонд, меченый флуорофором FAM, для ДНКUreaplasma sp. флуорофоромR6G, для ДНК Mycoplasma genitalium –  ROX, для ДНК ВКО - Cy5, идляДНКMycoplasma hominis – Cy 5.5. Соответствующие каналы детекции присутствуют у 5-канального и 6-канального варианта прибора «Rotor-Gene 6000».

Следует отметить, что для реализации независимой мультиплексной детекции различных ДНК-мишеней необходимо использование флуорофоров, спектральные характеристики которых четко различаются и соответствующих им каналов, обеспечивающих независимую детекцию сигналов каждого из флуорофоров. Среди широко применяемых для ПЦР с детекцией в режиме реального времени флуорофоров для таких целей может быть использована, например, комбинация перечисленных выше флуорофоров FAM, R6G, ROX, Cy5 и Cy5.5, тогда как одновременное использование в мультиплекс-ПЦР флуорофоров, имеющих близкие спектральные характеристики (например, флуорофора TAMRA, испускающего свет с длиной волны около 575 нм, вместе с такими флуорофорами как HEX (TET, VIC)) не может быть эффективным решением для независимой детекции различных ДНК-мишеней.

При тестировании с использованием нового комплекта реагентов «мультиплекс-уро-4» было показано, что прибор «Rotor-Gene 6000» позволяет успешно проводить данный тест с мультиплексной детекцией 5 ДНК-мишеней. При этом показатели аналитической чувствительности по каждому из выявляемых микроорганизмов соответствуют чувствительности моно-реакции для выявления данного микроорганизма и составляют 10³ ГЭ/мл для ДНК Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium, и 10⁴ ГЭ/мл для ДНК Mycoplasma hominis и Ureaplasma sp. При этом не наблюдалось неспецифического нарастания флуоресцентного сигнала по каждой из ДНК-мишеней при наличии амплификации любой другой ДНК-мишени (детектируемой по другому каналу), при стартовой концентрации последней около 10⁸ ГЭ/мл.

Стоит отметить, что специальное меню анализа данных мультиплексных тестов, имеющееся в программе «Rotor-Gene 6000», позволяет выполнять автоматический учет результатов и быстро получать суммарный результат анализа по всем ДНК-мишеням (графа «Генотип» в таблице результатов). Для этого используется заданный и сохраненный шаблон анализа и интерпретации результатов данного теста. Автоматический учет результатов обеспечивает их стандартизацию и исключение субъективных ошибок на данном этапе анализа. Пример результатов, полученных при проведении данного мультиплексного теста с использованием прибора «Rotor-Gene 6000» и его программного обеспечения представлен на рисунке 1.

 Рис.1 Пример результатов мультиплексного теста для выявления и дифференциации в формате мультиплексной ПЦР 4 различных микроорганизмов, вызывающих ИППП: Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmasp. иMycoplasmahominis(5 ДНК-мишеней, включая ВКО),выполняемого с помощью пяти- или шестиканального прибора «Rotor-Gene 6000».

Прибор «Rotor-Gene 6000» прошел также независимые медицинские испытания на базе ЦКЛД ГВКГ им. Академика Н.Н. Бурденко. По результатам испытаний, проведенных на базе ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии и на базе ЦКЛД ГВКГ им. Академика Н.Н. Бурденко, прибор «Rotor-Gene 6000» признан выдержавшим испытания, соответствующим требованиям, предъявляемым к данному виду изделий медицинской техники, и рекомендован для регистрации и использования при проведении молекулярно-диагностических исследований в лабораториях лечебных и лечебно-профилактических учреждений. Прибор «Rotor-Gene 6000» зарегистрирован отделом регистрации зарубежной медицинской техники Управления регистрации лекарственных средств и медицинской техники Федеральной Службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (рег.удостоверение ФС №2006/1222).

Заключение.

В настоящее время прибор для проведения амплификации с детекцией в режиме реального времени «Rotor-Gene» модель «6000» зарегистрирован в РФ и внесен в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники. Данный прибор является удобной многофункциональной системой для молекулярно-генетических анализов. Его основными отличительными особенностями являются возможность использования до 6 каналов детекции флуоресцентного сигнала, русифицированное программное обеспечение и наличие новых функциональных возможностей, позволяющих выполнять исследования методом HRM (плавление с высоким разрешением). По результатам медицинских испытаний данный прибор рекомендован для использования при проведении молекулярно-диагностических исследований в лабораториях лечебных и лечебно-профилактических учреждений.