Выявляемость генотипов вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска при раке и предраковой патологии шейки матки

Выявляемость генотипов вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска при раке и предраковой патологии шейки матки

Введение

Общепризнано, что этиологической причиной рака шейки матки (РШМ) являются вирусы папилломы человека (ВПЧ) группы высокого канцерогенного риска, которые, по данным широких международных исследований, обнаруживаются практически в 100% случаев РШМ. Однако, существуют также и данные о встречаемости ВПЧ-негативных РШМ, доля которых составляет не более 10% - для плоскоклеточных карцином и более 10% - для аденокарцином. Действительно ли ВПЧ может отсутствовать в раковой ткани, или просто не выявляется по причине низкой чувствительности ВПЧ-тестов пока до конца не выяснено.

В пользу существования ВПЧ-негативных РШМ выдвигают два различных объяснения. Первое из них основано на предположении, что канцерогенез в этих раках происходит без участия вируса, а инициируется другими индукторами канцерогенеза. Другое объяснение предусматривает трансформирующее воздействие вируса на клетки. Вирусная ДНК интегрируется в геном клетки, вызывая его дестабилизацию, но при неконтролируемом делении трансформированных клеток, происходит делеция интегрированной вирусной ДНК, что приводит к появлению опухолевых клонов, не содержащих последовательностей вирусной ДНК.

Сторонники точки зрения отсутствия ВПЧ-негативных РШМ придерживаются мнения, что используемые для выявления и определения генотипа ВПЧ-тесты обладают недостаточной чувствительностью, т.к. выявляют не все типы вируса. В международной практике изучении встречаемости различных генотипов ВПЧ в образцах РШМ, используются ВПЧ-тесты на основе полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (GP5+/GP6+ или SPF), которые находятся в области L1-гена ВПЧ и узнают большинство генотипов ВПЧ группы α, включая как типы высокого, так и низкого канцерогенного риска. Определение генотипа ВПЧ проводится с помощью гибридизации на фильтрах к которым прикреплены ДНК-пробы, специфичные для отдельных генотипов ВПЧ. Аналитическая чувствительность выявления достаточно высокая, но варьирует в зависимости от типа ВПЧ. При наличии в образце ВПЧ двух генотипов, один из которых в высокой концентрации, а другой – в значительно более низкой, эффективность амплификации ДНК второго типа может быть снижена вследствие конкурентного взаимодействия. Так, например, при наличии в образце ВПЧ высококанцерогенного 18 типа в количестве 10³ геномов и ВПЧ низкоканцерогенного, например, 73 типа в количестве 10⁸ геномов, 18-й тип ВПЧ скорее всего не выявится, а выявленный 73 тип может быть ошибочно признан этиологической причиной РШМ и отнесен в эпидемиологической классификации в группу канцерогенных типов ВПЧ. Во избежание этой ошибки, для выявления и определения генотипов ВПЧ предпочтительней использовать ПЦР с типоспецифическими праймерами. Кроме того, учитывая, что при трансформации клетки вирусом только часть вирусного генома (чаще область генов E6-E7) может встраиваться в геном человека, а остальные гены (E1, E2, а иногда и L1) могут быть утерянными, типоспецифические праймеры для генотипирования ВПЧ следует выбирать в области E6-E7 генов.

С другой стороны, в качестве клинического материала для молекулярно-эпидемиологических исследований чаще всего используют кусочки опухолевой ткани, которые забирают не всегда одноразовыми инструментами. В этой ситуации повышается риск перекрестной контаминации уже на стадии забора клинического материала или впоследствии при проведении различных манипуляций одновременно с несколькими клиническими образцами. Например, если большая часть клинических образцов содержит наиболее распространенный в раке 16 тип ВПЧ в высокой концентрации, то образцы, исходно не содержащие этот тип, могут вследствие контаминации содержать его в фоновых концентрациях. Вследствие этого, при использовании ВПЧ тестов с высокой аналитической чувствительностью, будет выявляться тип-контаминант, что  может приводить к ошибочному заключению о ведущей роли этого генотипа как причины рака. Во избежание этой ошибки, необходимо использовать тесты для генотипирования, позволяющие оценивать количество ДНК ВПЧ обнаруженных типов, чтобы отделить значимый тип ВПЧ от незначимого типа, который может присутствовать вследствие фоновой контаминации образцов.

Для выявления и генотипирования ВПЧ высокого канцерогенного риска в клинических образцах нами была разработана ПЦР-тест-система «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип FRT», позволяющая дифференцировать   12 генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска в формате «мультиплекс» с использованием типоспецифических праймеров расположенных в области E6-E7 генов ВПЧ и детекцией результатов ПЦР в режиме реального времени. ПЦР-тест-система была охарактеризована с помощью панели контрольных образцов, содержащих как специфические, так и неспецифические типы ВПЧ в различных концентрациях.

Цель исследования – используя разработанную тест-систему, оценить частоту встречаемости различных генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска в образцах эпителия шейки матки с наличием дисплазии высокой степени тяжести и при первичном раке на разных стадиях его развития в клинических образцах от пациенток Москвы и Московской области.

Материал и методы

Материалом для исследования служили образцы эпителия шейки матки, забранные с использованием одноразовых цервикальных цитощеток в транспортную среду «Cytoscreen System» («Seroa», Италия) для жидкостной цитологии или в транспортную среду «АмплиСенс» для забора материала из урогенитального тракта женщин. Все образцы были верифицированы гистологически. Всего было исследовано 125 образцов верифицированных как В-ПИП/H-SIL (ЦИН 2/3), 22 образца – рак in situ/CIS, 81 образец – плоскоклеточная карцинома/SCCa (46 образцов – 1,2 стадия рака, 35 образцов – 3,4 стадия рака), 10 образцов - аденокарцинома/AdCa. Материал забирали только от женщин с первично выявленным заболеванием, ранее не леченных.

Для экстракции ДНК из клинического материала использовали комплекты реагентов «ДНК-сорб-А» - для образцов, забранных в транспортную среду «АмплиСенс» и «ДНК-сорб-Д» - для образцов, забранных в транспортную среду «Cytoscreen System». Для выявления и определения  и определения генотипа ВПЧ использовали тест-систему «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип FRT». Образцы, в которых не удалось выявить ДНК ВПЧ ВКР, были протестированы с помощью ПЦР с универсальными праймерами MY11/MY09 и GP5+/GP6+ в формате «nested»-ПЦР с последующим секвенированием амплифицированной ДНК с целью определения генотипа ВПЧ.

Результаты

Результаты выявления ДНК ВПЧ 12-ти генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) в исследуемых клинических образцах представлены в таблице 1 и на диаграмме 1. Результаты определения в каждой группе клинических образцов процентной доли образцов с 16, 18 и 45 генотипами по отношению к образцам, содержащим другие генотипы, представлены на диаграмме 2. 

 

Таблица 1. Количество образцов, в которых выявлены ДНК различных типов ВПЧ ВКР в значимой концентрации и распределение генотипов по группам.

* - в образцах обнаружены только 16 и 18 типы ВПЧ, причем доля образцов с ВПЧ18 составляет 75% (3 из 4).

 

Диаграмма 1. Доля образцов, содержащих ДНК ВПЧ ВКР в значимой концентрации, в группах с разными стадиями предрака (H-SIL, CIS) и  РШМ (SCCa, AdCa).

 

Диаграмма 2.

Доля образцов, содержащих ДНК ВПЧ 16, 18 и 45 (столбики, заштрихованные горизонтальной полоской) или 31, 33, 35, 39, 51, 52, 56 58, 59 типов высокого канцерогенного риска (столбики, заштрихованные вертикальной полоской) в значимой концентрации, в группах с разными стадиями предрака и РШМ.

 

Из данных, представленных на диаграмме 1 следует, что при прогрессировании из стадии предрака в рак, а также при увеличении стадии рака, наблюдается тенденция к увеличению доли ВПЧ-негативных случаев. 

При определении генотипов ВПЧ в исследуемых группах, мы обнаружили, что доля образцов, содержащих 16, 18 и 45 типы, также увеличивается при переходе из группы с предраковыми заболеваниями к группе с РШМ. Следует отметить, что широко распространенные в популяции 51 и 56 типы ВПЧ встречаются при дисплазии высокой степени тяжести (H-SIL), но не встречаются в случаях преинвазивного и инвазивного рака (таблица 1). Известно, что небольшой процент дисплазий высокой степени тяжести может подвергаться регрессии. Возможно, дисплазии связанные с этими типами ВПЧ, менее канцерогенными, чем ВПЧ 16, 18 и другие, подвергаются регрессии чаще. Это явление требует дальнейшего более детального изучения.

Выводы

По результатам наших исследований, частота обнаружения ВПЧ-негативных плоскоклеточных карцином составляет около 10%, причем их доля зависит от стадии рака. Частота обнаружения аденокарцином, не содержащих ДНК ВПЧ, составляет 60%. Чтобы ответить на вопрос, связано ли это явление с возможным альтернативным ВПЧ-независимым канцерогенезом, или это результат «потери» клетками вирусной ДНК при прогрессировании рака, необходимо провести дополнительные исследования.

Частота встречаемости различных генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска неодинакова в случаях предрака и при раке шейки матки. Так, генотипы 51 и 56 встречались только при дисплазии высокой степени тяжести. Какова вероятность прогрессирования из дисплазии в рак при наличии этих типов ВПЧ, необходимо выяснить.