Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методом ПЦР

Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методом ПЦР

Оглавление

Аннотация

Введение

Нормативные ссылки

Описание метода

Формула метода

Материально-техническое обеспечение*

Средства измерения

Оборудование

Вспомогательные изделия и материалы

Реактивы и растворы

Способы обеззараживания материала, исследуемого методом ПЦР

 

АННОТАЦИЯ

В настоящих указаниях предложены способы обеззараживания материала зараженного или подозрительного на зараженность бактериями I-IV групп патогенности при проведении генодиагностических исследований методом ПЦР.

Указания предназначены для специалистов санитарно-гигиенических, лечебно-профилактических учреждений, генодиагностических центров и лабораторий, применяющих метод ПЦР для обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний.

РАЗРАБОТАНО: Российским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб" г.Саратов.

 

ВВЕДЕНИЕ

Внедрение в практику лабораторной диагностики инфекционных болезней полимеразной цепной реакции (ПЦР) должно быть обеспечено соответствующими методами подготовки проб, предусматривающими, обеззараживание исследуемого материала.

Используемые обычно в практике табельные средства стерилизации (растворы формалина, хлорамина, перекиси водорода и др.) не могут быть применены при ПЦР-анализе вследствие повреждающего действия на ДНК или ингибирования ПЦР.

В существующих Санитарных Правилах 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности не предусмотрено выполнение современных генетических методов, в том числе - полимеразной цепной реакции, которая в настоящее время широко используется для обнаружения различных микроорганизмов, включая и возбудители опасных инфекций.

В настоящих методических указаниях для работы с не образующими споры бактериями I-II групп патогенности предлагается обработка обьектов мертиолятом натрия с последующей обработкой лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом. При работе с возбудителем холеры может быть использован метод прогревания при 100°С в течение 30 минут.

Для инактивации не образующих споры микроорганизмов III-IV групп патогенности может быть использован метод термической обработки при 100°С в течение 30 минут или лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом.

Для обеззараживания материала, содержащего спорообразующие микроорганизмы, в том числе Bacillus anthracis применяют методический подход, заключающийся в герминации спор с последующей обработкой пенициллином , прогреванием при 100°С и обработкой лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом.

Разработанные способы инактивации приводят к полному обеззараживанию материала, не повреждают ДНК и не ингибируют ПЦР.

 

НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

Санитарные Правила 1.2.011-94 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности» М. 1994г.

Санитарные Правила 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами» М. 1999г.

Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного или холерного микробов. Саратов 1982 г.

Временная фармакопейная статья (ВФС) 42-62-ВС-86 для диагностикума бруцеллезного жидкого для реакции агглютинации .

Методические указания "Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза." М. 1975 г.

Руководство по профилактике чумы. Саратов 1992 г.

 

ОПИСАНИЕ МЕТОДА

Формула метода

Рекомендуемые средства стерилизации материала при ПЦР-анализе имеют следующие механизмы антимикробного действия. Мертиолят натрия необратимо связывается с SH-, NH₂- и COOH-группами белковых молекул с дальнейшим ингибированием дыхательной цепи микроорганизма.

 Инактивирующий эффект лизирующего буфера обусловлен действием хаотропного агента - гуанидинтиоцианатом, обеспечивающим разрушение клеточных мембран и лизис клеток с последующим выходом ДНК.

Метод обеззараживания содержащих споры микроорганизмов основан на прорастании споры в вегетативные клетки при культивировании в благоприятных для герминации условиях. Далее под воздействием температуры (для сибиреязвенного микроба еще и пенициллина) происходит разрушение клеточной мембраны и выход ДНК.

 

Материально-техническое обеспечение*

* указанные средства измерения и оборудование может быть заменено на аналогичную по характеристикам продукцию других фирм.

 

Средства измерения

.      Весы PG 203 - прецизионные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары и другими вспомогательными функциями, стандартного уровня, максимальная загрузка - 210 г, погрешность при измерении-0,001 г, (Mettler, Швейцария);

.      Иономер рН-150 (рН-метр-милливольтметр); используется для определения рН буферных растворов диапазон рН от -1 до 14, точность 0,01 рН, температура анализируемой среды от -10° до 100°С ( Белоруссия).

 

Оборудование

.      Дистиллятор А1013 - производительность 7,6 л/ч (Barustead,США);

.      Термостат ЕВ- объем от 18 до 1000 л с регулируемым диапазоном температур от 5⁰ до 80⁰ С, (Jouan, Франция);

.      Встряхиватель V-4 типа вортекс- регулируемый, (Elmi, Латвия);

.      Микроцентрифуга для пробирок типа Eppendorf -СМ-50 -12х1,5 (0,5) мл ,до 12000 об/мин, ротор - угловой, (Elmi, Латвия);

.      Баня водяная J-12 (18,30) с корпусом из нержавеющей стали с термометром, на 12,18,30л, вместимостью соответственно 72,108 и 192 пробирки диаметром 16 мм; максимальная температура 100⁰ С, (Jouan, Франция).

 

Вспомогательные изделия и материалы

.      Вата медицинская ГОСТ 5556-81;

.      Микроцетрифужные пробирки-виалы типа Eppendorf 0,5-1,5 мл;

.      Колбы мерные ГОСТ 12738-77 50, 100, 200 мл;

.      Лабораторный штатив ТУ 64-17-07-72;

.      Микродозаторы «Ленпипет» Россия, 1-20,20-200,200-1000 мкл;

.      Наконечники для микродозаторов «Ленпипет», Россия;

.      Пробирки ГОСТ 10-515-75;

.      Пипетки мерные ГОСТ 20292-74;

.      Цилиндры мерные ГОСТ 1770-74 1-25, 1-100, 1-1000мл.

 

Реактивы и растворы

.      Вода дистиллированная;

.      Вода деионизованная;

.      ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) ГОСТ10652-73;

.      Натрия гидроокись ГОСТ4328-77;

.      Гуанидинтиоцианат “Serva” Германия;

.      Дитиотрейтол;

.      Соляная кислота ХЧ ГОСТ 3118-67;

.      Спирт этиловый ГОСТ 183000-87 (ректификат);

.      Мертиолят натрия;

.      Бензилпенициллин.

 

СПОСОБЫ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ МАТЕРИАЛА, ИССЛЕДУЕМОГО МЕТОДОМ ПЦР

Вся работа с исследуемым материалом, подозрительным на зараженность микроорганизмами I-II групп патогенности проводится в соответствии с СП 1.2.011.-94 “Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности.” М.1994 г.

Отобранные для исследования пробы могут быть инактивированы следующими способами:

1. Материал (кровь, биологические жидкости, экстракты органов, смывы с поверхностей, фильтраты почвы), подозрительный на зараженность не содержащими споры микроорганизмами I-II групп патогенности

1.1. Обработка мертиолятом натрия с прогреванием при температуре 56°С: к исследуемым образцам добавляют мертиолят натрия, проверенный на бактерицидное действие , до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием их при 56°С в течение 30 минут.

1.2. Обработка лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом и прогреванием при температуре 65°С: к 100 мкл обработанных мертиолятом натрия образцов (п.1.1.), разлитым в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф добавляют 300 мкл лизирующего буфера и инкубируют 15 минут при температуре 65°С. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным. Далее для выделения ДНК используют метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента. ПЦР выполняют по общепринятой методике в соответствии с указаниями к ПЦР наборам изготовителя.

1.3. Приготовление лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом

Гуанидинтиоцианат ( конечная концентрация 6М ) - 18 г, дитиотрейтол (0,2М ) - 95 мг и ЭДТА (0,5М ) – 1мг - растворяют в 30 мл дистиллированной воды. Готовый раствор, провереннный на бактерицидное действие, хранится в темной посуде в холодильнике до 6 месяцев.

2. Материал, подозрительный на зараженность не содержащими споры микроорганизмами III-IV групп патогенности

2.1. Прогревание при 100°С в течение 30 минут.

2.2. Обработка лизирующим буфером с гуанидинтиоциа натом и прогреванием при 65°С в течение 15 минут,  как описано в п. 1.2.
Исследуемые образцы в количестве 100 мкл помещают  в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф, смешивают с 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при 65°С в течение 15 минут.

После лизиса гуанидинтиоцианатом для выделения ДНК используют метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента.

ПЦР выполняют по общепринятой методике в соответствии с указаниями к ПЦР наборам изготовителя.

3. Материал, подозрительный на зараженность содержащими споры микроорганизмами II-IV группы патогенности

3.1. Герминация спор с обработкой пенициллином  и прогреванием при 100°С в течение 10 минут.

Исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера рН 7,6 и инкубируют с аэрацией при температуре 37°С в течение 2,5 часов. Добавляют пенициллин (1000ед/мл) и инкубируют при 37°С – 15 минут. Затем прогревают на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 минут.

3.2. Обработка лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом и прогреванием при температуре 65°С : к 100 мкл обработанных как описано в п. 2.1. образцов, разлитым в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф добавляют 300 мкл лизирующего буфера и инкубируют 15 минут при температуре 65°С. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным. Далее для выделения ДНК используют метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента. ПЦР выполняют по общепринятой методике в соответствии с указаниями к ПЦР наборам изготовителя.

После инактивации проб любым из вышеописанных способов дальнейшие исследования проводятся как с обеззараженным материалом.