Методика проведения исследования мазков соскобов клеточных осадков мочи на наличие ДНК-возбудителей ИППП методом ПЦР с ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ

Методика проведения исследования мазков соскобов клеточных осадков мочи на наличие ДНК-возбудителей ИППП методом ПЦР с ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ

Оглавление

Общая информация.

Клинический материал, доставка, хранение.

Меры предосторожности.

Проведение анализа.

ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.

Необходимое оборудование.

Необходимые реактивы.

Первичная подготовка клинического материала для выделения ДНК.

ЭТАП 2. ПОСТАНОВКА ПЦР.

Необходимое оборудование.

Необходимые реактивы.

Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

ЭТАП 3. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ПЦР.

Необходимое оборудование.

Необходимые реактивы.

Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.

Порядок работы.

Учет и интерпретация результатов.

Обезвреживание.

ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ВОЗБУДИТЕЛИ

Бактериальные инфекции:

· Chlamydia trachomatis
· Ureaplasma spp.
· Ureaplasma urealyticum/parvum
· Mycoplasma hominis
· Mycoplasma genitalium
· Trichomonas vaginalis
· Neisseria gonorrhoeae
· Gardnerella vaginalis
· Candida albicans

Вирусные инфекции:

· Вирус простого герпеса I+II типов (HSVI/II)

· Цитомегаловирус (CMV)

ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Исследование разделяется на три этапа и проводится в трех изолированных помещениях (ЗОНАХ), согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции», утвержденным в 1995 году ГК СЭН.

В ЗОНЕ 1 проводится первичный разбор, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и выделение ДНК из клинического материала.

В ЗОНЕ 2 проводится подготовка пробирок для постановки ПЦР и проведение ПЦР.

В ЗОНЕ 3 проводится электрофоретический анализ продуктов амплификации и документирование результатов с помощью видеосистемы.

Анализ результатов и введение готовых результатов в журнал проводится аккредитованным врачом-лаборантом.

КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ, ДОСТАВКА, ХРАНЕНИЕ

Перед началом работы следует ознакомиться с «Методическими рекомендациями по взятию, транспортировке, хранению и пробоподготовке биологического материала для ПЦР-диагностики».

Для проведения анализа используется следующий клинический материал:

1. У женщин: соскобы (мазки) из уретры, цервикального канала, нижнего свода влагалища, осадки клеток первой порции утренней мочи, помещенные в 300 мкл транспортной среды * ;

2. У мужчин – соскобы из уретры, осадки клеток первой порции утренней мочи, помещенные в 300 мкл транспортной среды, секреты предстательной железы;

3. У детей – осадки клеток первой порции утренней мочи, мазки с конъюнктивы, помещенные в 300 мкл транспортной среды.

* Состав транспортной среды: физраствор, 0,05%-ный азид натрия.

Хранить материал можно не более суток при 2-8^оС и в течение года при температуре минус 70^оС. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Доставка проб осуществляется в специальном контейнере с охлаждающими элементами.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Необходимо строгое соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы здравоохранения СССР», Москва, 1981 г.

Работают только в одноразовых перчатках, используют и меняют при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток (на отдельных этапах только с аэрозольным барьером). Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 5%-ный раствор хлорамина Б.

При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги лица и слизистой глаз.

Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перенос из одного помещения в другое. Персонал, работающий в комнате для детекции продуктов амплификации (зона 3) не должен посещать помещения для обработки клинического материала (зона 1) и проведения ПЦР-амплификации (зона 2). Смена верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофореза.

Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, должны обязательно до начала и после начала работ облучаться ультрафиолетовым светом.

 

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Объем подготовленного клинического материала для анализа – 0,1 мл. Проводится в ЗОНЕ 1 - комнате для обработки клинического материала.

Необходимое оборудование

1. Настольный бокс с бактерицидной лампой.

2. Термостат для пробирок 1.5 мл (типа «Эппендорф») на 25-100 °С.

3. Настольная центрифуга для пробирок 1.5 мл (типа «Эппендорф») до 16000 g .

4. Микроцентрифуга/вортекс.

5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости.

6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (5-40 мкл, 40-200 мкл,
200 – 1000 мкл)

7. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.

8. Одноразовые пробирки на 1,5 мл (типа Эппендорф).

9. Штативы «рабочее место» для пробирок на 1,5 мл (типа Эппендорф).

10. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема без фильтра до 200 мкл.

11. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл.

12. Холодильник на 2- 8 °С.

13. Ёмкость с дезинфицирующим раствором.

 

Необходимые реактивы

Комплекты «ДНК-сорб-А» и «ДНК-сорб-АМ»

Комплект рассчитан на выделение ДНК из 100 проб, включая контрольные.

Дополнительно к комплектам
«ДНК-сорб-А» и «ДНК-сорб-АМ» прилагаются следующие реактивы

Первичная подготовка клинического материала для выделения ДНК

До начала работы необходимо подготовить пробы для выделения из них ДНК (см. «Методические указания по взятию, транспортировке, хранению и пробоподготовке биологического материала для ПЦР-диагностики». Лизирующий раствор (если он хранился при 2-8 ° С) прогреть при 60–65 ° С до полного растворения кристаллов.

1. Порядок работы с использованием комплекта «ДНК-сорб-А».

1. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1.5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО-комплексный (если он предусмотрен) и по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки.

2. В пробирки с лизирующим раствором и ВКО, внести по 100 мкл клинического образца, используя для каждой наконечники с фильтрами. В пробирку для отрицательного контроля (ОК) выделения внести 100 мкл ОКО.

3. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65° С.

4. Центрифугировать 5 сек. при 5 тыс. об./мин. на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс. об./мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.

5. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 20 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 минуты, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 минут.

6. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс об./мин в течение 30 с. Удалить супернатант в колбу-ловушку, используя вакуумный отсасыватель и отдельный для каждой пробы наконечник без фильта.

7. Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 сек. при 10 тыс. об./мин на микроцентрифуге. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный для каждой пробы наконечник без фильтра.

8. Повторить отмывку еще раз, следуя пункту 7., удалить супернатант полностью.

9. Поместить пробирки в термостат 65° С на 5-10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

10. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат 65° С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

11. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс. об./мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

2. Порядок работы с использованием комплекта «ДНК-сорб-А M ».

1. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок 1,5 мл (включая отрицательный контроль выделения) и внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО-комплексный, используя наконечник с фильтром.

2. Ресуспендировать сорбент до гомогенной консистенции, внести в каждую пробирку по 20 мкл сорбента и по 300 мкл лизирующего раствора, используя наконечники с фильтрами. Промаркировать пробирки.

3. В пробирки согласно маркировке внести по 100 мкл клинического образца, используя отдельный для каждой пробы наконечник с фильтром. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100 мкл ОКО.

4. Пробы тщательно перемешать на вортексе и инкубировать 5 мин. при 65° С в термостате. После окончания инкубации перемешать на вортексе и поставить в штатив на 2-3 минуты. Еще раз перемешать содержимое пробирок на вортексе и оставить в штативе на 5 минут.

5. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 10 тыс. об./мин. в течение 30 сек. Не захватывая сорбент, удалить супернатант в колбу-ловушку с помощью вакуумного отсасывателя, используя отдельный для каждой пробы наконечник без фильтра.

6. Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.

7. Повторить п.5

8. Поместить пробирки в термостат 65° С на 5-10 мин. для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

9. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат 65° С на 5 мин.

10. Центрифугировать пробирки при 12 тыс. об./мин. в течение 1 мин. на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при 2-8° С и в течение 1 года при минус 20° С.

ЭТАП 2. ПОСТАНОВКА ПЦР

Общий объем реакции – 25 мкл, объем ДНК-пробы – 10 мкл. Проводится в ЗОНЕ 2 – комнате для подготовки и проведения ПЦР-амплификации.

Необходимое оборудование

1. Амплификатор ( например , « Терцик » ( ДНК - технология ); «GeneAmp PCR System 2400», «GeneAmp PCR System 2700» (Applied Biosystems); «Gradient Palm Cycler» (Corbett Research); «Biometra».

2. ПЦР-бокс

3. Микроцентрифуга/вортекс.

4. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (5-40 мкл, 40-200 мкл).

5. Штативы «рабочее место» для микропробирок на 0,5 мл.

6. Одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл или 0,2 мл.

7. Одноразовые наконечники до 100 мкл с фильтрами в штативах для автоматических пипеток с переменным объемом.

8. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

9. Емкость для сброса наконечников.

10. Холодильник на 2- 8 °С; морозильник на минус 20 °С для хранения выделенной ДНК.

Необходимые реактивы

Комплект «АмплиСенс»

* - ПЦР-смесь-1 помещена под воск.

Контрольные образцы

Во всех наборах для амплификации семейства АмплиСенс обязательно применяется «горячий старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq -полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при установке пробирок в амплификатор, нагретый до 95⁰С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.

Подготовка пробирок для проведения ПЦР

1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1 и воском для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

2. Внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1.

3. Сверху добавить по капле масла для ПЦР (примерно 15-25 мкл).

4. Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с фильтрами внести по 10 мкл ДНК, выделенной из клинических проб или контролей этапа выделения.

5. Дополнительные пробирки предназначаются для контролей этапа ПЦР (см. ниже):

а) отрицательный контроль (К-) вместо ДНК-пробы внести в подготовленную пробирку 10 мкл ДНК-буфера;

б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл положительного контрольного образца ДНК (ПКО);

6. Запустить на амплификаторе нужную программу (см. табл.).

Программы амплификации ДНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем.

7. Когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 ° С, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.

8. После окончания реакции пробирки отправить в комнату для анализа продуктов ПЦР (ЗОНУ 3). Пробы после амплификации можно хранить в течение 16 часов при комнатной температуре, до одной недели при 2-8°С и длительно при минус 20°С (однако перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска). Анализ продуктов амплификации проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.

ЭТАП 3. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ПЦР.

Проводится в ЗОНЕ 3 – комнате для анализа продуктов амплификации.

РАБОТА С ПРОДУКТАМИ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК ДОЛЖНА ПРОВОДИТЬСЯ В ОТДЕЛЬНОЙ КОМНАТЕ, СОТРУДНИКОМ ЛАБОРАТОРИИ, НЕ ПРОИЗВОДЯЩИМ МАНИПУЛЯЦИЙ В ЗОНЕ 1 И ЗОНЕ 2.

 

Необходимое оборудование

1. Камера для горизонтального электрофореза объёмом не более 400 мл (например, SE -2 компания «Хеликон» Россия).

2. Источник постоянного тока с напряжением 150 – 460 В.

3. Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей.

4. Видеосистема с цифровой камерой для регистрации и передачи изображения.

5. Микроволновая печь для плавления агарозы.

6. Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы на 250 мл.

7. Мерный цилиндр на 1 литр.

8. Штативы «рабочее место» для микропробирок на 0,5 мл и 0.2 мл.

9. Отдельная автоматическая пипетка с переменным объемом 5- 40 мкл.

10. Одноразовые наконечники до 200 мкл без фильтров

11. Пластиковая ёмкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

12. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.

Необходимые реактивы

Комплекты «ЭФ»

Приготовление рабочих растворов и агарозного геля

1. Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл концентрированного ТБЕ, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.

ВНИМАНИЕ! Этидия бромид – канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой. Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке (см. раздел «Обезвреживание»).

2. Агарозу из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой – 1,5 минуты. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 минут. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 минуты (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до 65-70° С.

3. Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры. Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга. Толщина геля должна быть около 0,6 см.

4. После полного застывания геля (30 минут при комнатной температуре), осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху.

Порядок работы

1. Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать из-под слоя масла по 10–15 мкл проб и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК.

2. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры SE -2 («Хеликон») и источника питания «Эльф-4» («ДНК-технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза – 18-20 минут. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см.

3. По завершении времени электрофореза (краситель ксиленцианол при этом пройдет примерно половину длины геля – 1,5 см; краситель крезоловый красный – примерно 2/3 геля – 2 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, занести в базу данных.

Внимание!

При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной!

Учет и интерпретация результатов

Учет результатов проводится в помещении, не связанном с зонами ПЦР-анализа (зонами 1, 2, 3), куда изображение электрофореграммы передается по компьютерной сети.

Учёт результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированных фрагментов ДНК (см. таблицу).

Таблица 2. Длина амплифицированных специфических фрагментов

I . УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ ВКО.

Таблица 3. Оценка результатов анализа контрольных точек с применением ВКО

1. В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа выделения (ОК), должна быть только полоса амплифицированного фрагмента ДНК ВКО.

2. В дорожке положительного контроля этапа ПЦР (К+) должна быть только полоса амплифицированного фрагмента ДНК ПКО, и должны отсутствовать другие полосы, включая полосу амплифицированного фрагмента (ВКО).

3. В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа ПЦР (К - ), не должно быть никаких полос.

Таблица 4. Интерпретация результатов

4. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне продукта амплификации фрагмента ДНК возбудителя, независимо от наличия полосы ВКО. Полоса амплифицированного фрагмента ДНК ВКО может отсутствовать в пробах с высокой концентрацией ДНК возбудителя.

Примечание. При определении ДНК Neisseria gonorrhoeae в исследуемых пробах, амплификация проводится с двумя парами праймеров: “Neisseria gonorrhoeae ½” и “Neisseria gonorrhoeae ¾”, положительным считаются образцы, которые амплифицировались с обеими парами праймеров. Если амплификация идет только с одной парой праймеров, то такой результат расценивается как отрицательный.

5. Отрицательными считаются образцы, которые содержат только полосу амплифицированного фрагмента ДНК ВКО большей или меньшей интенсивности и не содержат полосу амплифицированного фрагмента ДНК возбудителя.

6. Кроме полос фрагмента ДНК возбудителя и ВКО в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы непрореагироваших праймеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар.

Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:

1. Если результаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в таблице 3.

2. Если в дорожке какой-либо из исследуемых проб отсутствуют обе полосы: амплификацированного фрагмента ДНК возбудителя и амплификациррованного фрагмента ДНК ВКО.

3. В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

4. Если в отрицательном контроле (ОК, К-) выявляется специфическая полоса амплифицированного фрагмента ДНК возбудителя, значит, произошла контаминация реактивов или проб.

Электрофореграмма результатов анализа с применением ВКО (см. табл. 4).

1 – 4, 6 – 10, 12 – 15, 17 – 20 – ДНК возбудителя не обнаружена (вариант D );
5 – ДНК возбудителя обнаружена (варианты А, В);
11 – рекомендуется провести повторную амплификацию ДНК в двух повторах (вариант С);
16 – Результат анализа учитывать нельзя – отсутствует полоса ВКО, повторить исследование пробы начиная с этапа выделения ДНК (вариант Е);
М – маркер молекулярных масс (сверху вниз 1200, 670, 550 и 330 п.о.).

II . УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА, ПРОХОДЯЩЕГО БЕЗ ПРИМЕНЕНИЯ ВКО.

Таблица 5 .Оценка результатов анализа контрольных точек без применения ВКО

1. В дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+), должна быть яркая специфическая светящаяся оранжевая полоса на уровне фрагмента ДНК возбудителя.

2. В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа выделения (ОК) и контролю этапа ПЦР (К-), не должно быть никаких полос.

3. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне амплифицированного фрагмента ДНК возбудителя.

4. Отрицательными считаются образцы, которые не содержат никаких полос.

5. Кроме полос амплифицированных фрагментов ДНК возбудителя в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар.

Результаты анализа без применения ВКО не подлежат учету в следующих случаях:

1. Если в дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+), отсутствует специфическая полоса амплифицированного фрагмента ПКО.

2. Если в дорожке, соответствующей положительному контролю выделения (ПК), отсутствует специфическая полоса амплифицированного фрагмента ПКО.

2. В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

3. Если в дорожках отрицательных контролей (ОК, К-) выявляются специфические полосы амплифицированных фрагментов ДНК возбудителя, значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ

Обезвреживание биоматериалов и реагентов проводят для каждого этапа ПЦР-анализа отдельно.

1. В зоне 1 помещают о дноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники), колбы-ловушки вакуумных отсасывателей, штативы для пробирок и наконечников на 20-24 ч в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующий 10 %-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б. Поверхности обрабатывают дезинфицирующими растворами и подвергают облучению ультрафиолетом.

2. В зоне 2 поверхности обрабатывают 70 % этанолом и облучают ультрафиолетом.

3. В зоне 3 поверхности подвергают облучению ультрафиолетом. Раз в месяц следует проводить влажную уборку с применением 5 %-ного раствора хлорамина Б.

Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 литров с плотно завинчивающейся крышкой. На 1 л обезвреживаемых реагентов добавляют 1 л 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 л 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 часов. Для нейтрализации добавляют 1 л 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Нейтрализованные реактивы сбрасывают в канализацию. Отработанный буфер можно дезактивировать с помощью стеклянной колонки емкостью на 1-2 л, заполненной активированным углем. Отработанный буфер пропускать через нее небольшими порциями. Дезактивированный раствор можно сливать в канализацию.

ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ. При температуре от 2° С до 20° С в течение суток.

ХРАНЕНИЕ. Комплекты №№ 1, 3 хранятся при температуре от 2° С до 20° С. Комплект № 2, транспортная среда для мазков, ВКО и ОКО при температуре от 2° С до 8° С.

СРОК ГОДНОСТИ. 6 месяцев.