Детекция генетических полиморфизмов с помощью систем генетического анализа на основе пиросеквенирования

Взависимости от вклада генетических факторов в патогенез заболевания выделяют моногенные и мультифакториальные заболевания. Большинство наблюдаемых в клинической практике патологических состояний являются мультифакториальными. В отличие от моногенных, эти заболевания обусловлены комбинированным действием неблагоприятных факторов окружающей среды и генетических факторов риска, определяющих наследственную предрасположенность. Риск возникновения мультифакториального заболевания, как правило, обусловлен полиморфизмами в нескольких генах, которые реализуются только при наличии соответствующих неблагоприятных факторов внешней среды.

К мультифакториальным заболеваниям относится подавляющее большинство хронических болезней человека, связанных с поражением сердечно-сосудистой, эндокринной и других систем организма. Также к этой группе заболеваний можно отнести некоторые инфекционные болезни и онкологические синдромы, на вероятность возникновения, тяжесть течения и прогноз которых может оказывать влияние неблагоприятное сочетание генетических факторов. Результаты популяционных исследований с применением подхода полногеномного скрининга ассоциаций (GWAS, Genome-Wide Association Study) позволяют определить генетические локусы, связанные с развитием наиболее частых мультифакториальных заболеваний. Поскольку проявление вклада генетических полиморфизмов в патогенез заболевания для мультифакториальных болезней всегда связано с влиянием провоцирующих факторов внешней среды, данные о генотипе могут учитываться при планировании профилактических мероприятий. Другим направлением медицинского использования результатов детекции генетических полиморфизмов являются фармакогенетические исследования, основная цель которых – индивидуальный подбор наиболее эффективных лекарственных средств и определение их оптимальной дозировки. На сегодняшний день показано, что на индивидуальный фармакологический ответ влияют полиморфизмы в генах ферментов, участвующих в процессах биотрансформации ксенобиотиков, а также генах, кодирующих молекулы, вовлеченные в транспорт лекарственных средств и продуктов их метаболизма. Поскольку возникновение мультифакториального заболевания или нежелательного фармакологического ответа может быть связано с полиморфизмами в нескольких генах, в исследование по оценке риска необходимо включать совокупность генетических локусов.

Наиболее распространенными в геноме человека являются однонуклеотидные полиморфизмы (SNP, Single-Nucleotide Polymorphism). Однонуклеотидными полиморфизмами принято считать замены, встречающиеся в наблюдаемой популяции с частотой не менее 1%. При изучении генетической предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям объектом клинического исследования могут являться уже описанные генетические полиморфизмы, информация о которых доступна через международные генетические базы данных.

С помощью ресурсов PubMed и OMIM (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) нами был проведен анализ литературных данных и выбраны мишени для детекции генетических полиморфизмов, ассоциированных с часто встречающимися в клинической практике заболеваниями и синдромами. Выбранные генетические полиморфизмы объединены в группы – профили исследований. При отборе генетических локусов учитывались результаты анализа полногеномного скрининга ассоциаций, доступные через интернет-сайт www.genome.gov/GWAStudies. Важным критерием включения полиморфизмов в профили генетических исследований были относительно высокие показатели значений отношения шансов, подтвержденные в независимых популяционных исследованиях.

Разработанные профили генетических исследований включают анализ однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных или вовлеченных в развитие патологических состояний и клинических синдромов, представленных в таблице 1.

В лабораторной практике для детекции генетических полиморфизмов используется широкий спектр молекулярно-биологических методов, основанных на ПЦР. Наибольшей точностью и специфичностью обладают методы, основанные на определении нуклеотидных последовательностей исследуемых генетических локусов. Применение секвенирования позволяет однозначным образом детектировать генетический полиморфизм в гомо- или гетерозиготном состоянии. Чувствительность различных методов секвенирования может отличаться, что может иметь значение для решения некоторых клинических задач, например при детекции соматических мутаций в опухолевых клетках. В нашей работе для детекции генетических полиморфизмов был использован метод пиросеквенирования, реализуемый на базе платформ генетического анализа PyroMark (Qiagen, Германия). Пиросеквенирование – метод определения нуклеотидной последовательности в режиме реального времени, основанный на детекции высвобождающегося пирофосфата при элонгации цепи ДНК в результате синтеза второй цепи ДНК на матрице одноцепочечной ДНК. Высвобождающийся пирофосфат проходит серию ферментативных превращений, в результате чего регистрируется хемилюминесцентный сигнал. Совокупность сигналов соответствует нуклеотидной последовательности анализируемого генетического локуса. Определение нуклеотидных последовательностей коротких известных фрагментов, соответствующих генетическим полиморфизмам, позволяет сократить время анализа.

С учетом требований и рекомендаций производителей оборудования для пиросеквенирования, а также накопленных в литературе данных был разработан протокол генотипирования выбранных генетических полиморфизмов, включенных в профили генетических исследований, и подготовлены к производству наборы реагентов для детекции генетических полиморфизмов.

Разработанная методика детекции генетических полиморфизмов включает следующие этапы:

1. Выделение ДНК из клинического материала. Проводится стандартными методами, нами были использованы комплекты реагентов «РИБО-преп» или «ДНК-сорб-B» производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.

2. ПЦР-амплификация фрагмента, содержащего полиморфный генетический локус. При амплификации фрагмента ДНК один из пары праймеров должен быть связан на 5’-конце с биотином; цепь ДНК, которая послужит матрицей для пиросеквенирования, амплифицируется с биотинилированым праймером.

3. Пробоподготовка ПЦР-продукта. Включает инкубацию ампликона с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином, денатурацию ампликона и серию последовательных отмывок, в результате которых образуется одноцепочечный ПЦР-продукт, фиксированный на частицах сефарозы.

4. Иммобилизация ПЦР-продукта на твердой поверхности и отжиг секвенирующего праймера в области анализируемого генетического локуса. В результате образуется дуплекс между ДНК-матрицей и секвенирующим праймером, необходимый для проведения реакции пиросеквенирующего синтеза.

5. Секвенирование ПЦР-продукта – проведение реакции пиросеквенирования и анализ полученных результатов.

Схема реакции пиросеквенирования представлена на рисунке 1.
Для проведения реакции пиросеквенирования нами были использованы системы генетического анализа PyroMark Q24 и PyroMark Q96 MD. Принцип работы приборов заключается в последовательном добавлении в реакционную смесь нуклеотидов и детекции хемилюминесцентного сигнала с помощью CCD-камеры прибора в случае встраивания во вновь синтезируемую цепь ДНК нуклеотида, комплементарного матрице. Основное отличие между приборами связано с пропускной способностью – возможностью одновременного анализа 24 и 96 образцов соответственно. Прибор PyroMark Q24 был использован для предварительной оптимизации процесса пробоподготовки, на этапе выбора параметров реакции пиросеквенирования и для оценки аналитических характеристик разрабатываемых тестов. Прибор PyroMark Q96 MD удобно использовать при анализе большого количества образцов и проведении расширенной клинической апробации разработанных тестов.

Поскольку объектом исследования являются охарактеризованные полиморфные локусы в геноме человека и положение однонуклеотидного полиморфизма известно, существует возможность для автоматической обработки результата программным обеспечением используемых приборов. На основании относительной высоты пиков на пирограмме определяется гомо- или гетерозиготное состояние по полиморфному локусу. Пример автоматической интерпретации результатов пиросеквенирования программным обеспечением PyroMark Q24 Software представлен на рисунке 2.

На основании обзора результатов опубликованных исследований, касающихся выявления связей генетических полиморфизмов с некоторыми заболеваниями, выбраны мишени для детекции полиморфизмов, ассоциированных с наиболее часто встречающимися в клинической практике патологическими состояниями и синдромами. Создана панель фармакогенетических тестов, включающая некоторые однонуклеотидные полиморфизмы в генах ферментов, вовлеченных в процессы биотрансформации лекарственных средств. Выбранные генетические полиморфизмы объединены в группы – профили генетических исследований, предназначенные для выявления аллелей риска, информация о которых может быть использована при оценке генетической предрасположенности к развитию некоторых заболеваний и нежелательных лекарственных реакций. Для детекции выбранных генетических полиморфизмов созданы тесты и адаптирована методика секвенирования для работы с системами генетического анализа PyroMark. В настоящее время проводится работа по расширению спектра анализируемых генетических полиморфизмов и профилей генетических исследований; планируется расширить группу фармакогенетических тестов за счет создания отдельных профилей для различных фармакологических препаратов. Создаются системы, направленные на выявление наиболее часто встречающихся соматических мутаций в генах KRAS и BRAF, и проводится поиск мишеней в геноме человека, ассоциированных с восприимчивостью к некоторым инфекционным заболеваниям.