Методические рекомендации по применению набора реагентов для выявления ДНК Legionella pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией Вариант FRT

25.04.2012

Методические рекомендации по применению набора реагентов для выявления ДНК Legionella pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией Вариант FRT

Утверждаю Директор Федерального бюджетного учреждения науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
В.И.Покровский
11.11.2011

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по применению набора реагентов

для выявления ДНК Legionella pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

«АмплиСенс^® Legionellapneumophila-FL»

Вариант FRT

НАЗНАЧЕНИЕ.

Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании набора реагентов для выявления ДНК Legionella pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс^® Legionella pneumophila-FL» вариант FRT совместно с приборами для ПЦР в режиме «реального времени» «Rotor-Gene» 3000 и «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research»).

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ.

Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу Rotor-Gene версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000 - программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build 67) или выше.

Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000.

ВНИМАНИЕ! Предварительно следует провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно инструкции к набору реагентов. При использовании прибора «Rotor-Gene» 3000 и «Rotor-Gene» 6000 рекомендуется использование прозрачных ПЦР-пробирок на 0,2 мл с плоской крышкой (детекция через дно пробирки).

Программирование амплификатора:

1. Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.

2. В открывшемся окне выбрать меню «Advanced»/«Детальный мастер» и шаблон запуска эксперимента «Dual Labeled Probe»/«Hydrolysis probes»/«Флуоресцентные зонды (TaqMan)». Нажать кнопку «New»/«Новый».

3. Выбрать тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Поставить отметку в окне рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».

4. Нажать кнопку «Next»/«Далее».

5. Выбрать объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции - 25 мкл. Для прибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 ml oil layer volume»/«15 μL объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, поставить ее с помощью мышки).

6. Нажать кнопку «Next»/«Далее».

7. В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».

8. Задать следующие параметры эксперимента:

9. Нажать кнопку «OK»/«Да».

10. В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation…»/«Опт.уровня сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Для обоих красителейнужно указать в графе Min Reading/Миним. Сигнал значение 5, а в графе Max Reading/Максим. Сигнал значение 10. В графе Tube position/Позиция Пробирки указан номер пробирки, по которой будет автоматически выбран параметр «gain»/«усиление сигнала», по умолчанию это 1-я пробирка в роторе. Поэтому в 1-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с реакционной смесью. Пометить галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before 1^st Acquisition»/«Perform Optimisation Before 1^st Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Закрыть окно Auto Gain Calibration Setup/Авто-оптимизация уровня сигнала, нажав кнопку «Close»/«Закрыть». Нажать кнопку «Next»/«Далее».

11. Поместить предварительно подготовленные пробирки в амплификатор. Запустить амплификацию кнопкой «Start run»/«Старт».

12. Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).

В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо запрограммировать положение пробирок в карусели. Для этого надо использовать кнопку «Edit samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна).

При проведении качественного анализа все пробы и контроли обозначить в меню Samples/Образцы как Unknown/Образец.

ВНИМАНИЕ! При проведении количественного анализа концентрации калибраторов ДНК Legionella pneumophila и калибраторов ДНК ВКО-STI-338 вводятся отдельно. Для этого в окне редактирования образцов необходимо сформировать 2 страницы. Первая страница (Page 1/Стр.1) предназначена для ввода значений концентрации ДНК ВКО-STI-338. Вторая страница (Page 2/Стр.2) предназначена для ввода значений концентрации ДНК Legionella pneumophila. На обеих страницах в колонке «Name»/«Имя» указать названия/номера исследуемых образцов, контролей и калибраторов. В колонке «Type»/«Тип» обозначить типы образцов, для исследуемых образцов установить тип Unknown/Образец, для калибраторов установить тип Standart/Стандарт, выбрав формат данных (Given Conc. Format/Формат Задан. Конц.): «1,235E+5» и единицы измерения (Unit/Единица): «copies/ml». На первой странице (Page 1/Стр.1) в соответствующий столбец (Given Conc./Задан. Конц.) необходимо внести значения концентрации ДНК ВКО-STI-338 в образцах калибраторовLS1, LS2 и LS3, указанные во вкладыше к тест-системе. На второй странице (Page 2/Стр.2) в соответствующий столбец (Given Conc./Задан. Конц.) необходимо внести значения концентрации ДНК Legionella pneumophilaв образцах калибраторовLS1, LS2 и LS3, указанные во вкладыше к набору реагентов.

АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ КАЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА.

Анализ результатов амплификации ВКО.

1. Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», выбрать в меню «Cycling A. FAM»/«Cycling A. Green», нажать кнопку «Show»/«Показать».

2. Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должны быть активированы кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррек. уклона».

4. Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкалавидна кнопка Log scale/Лог.шкала).

5. В меню окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов» установить значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) - 10%.

6. В меню «CT Calculation»/«Вычисление CT» (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.05.

7. В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные Результаты») появятся значения Ct.

Анализ результатов амплификации ДНК Legionella pneumophila.

1. Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», выбрать в меню «Cycling A. JOE»/«Cycling A. Yellow», нажать кнопку «Show»/«Показать».

2. Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должны быть активированы кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррек. уклона».

4. Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкалавидна кнопка Log scale/Лог.шкала).

5. В меню окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов» установить значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) - 10%.

6. В меню «CT Calculation»/«Вычисление CT» выставить Threshold/Порог = 0.05.

7. В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные Результаты») появятся значения Ct.

Учет результатов качественного анализа.

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и выделения ДНК (см. табл. 1).

Таблица 1.

Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-анализа

1. Образец считают положительным, если значение Ct на канале JOE/Yellow менее 33.

2. Образец считают отрицательным, если по каналу JOE/Yellow для него значение Сt отсутствует, а по каналу FAM/Green для него определено значение Ct, не превышающее 28 для образцов клинического материала и не превышающее 25 для образцов окружающей среды.

Результаты не подлежат учету:

1. Если значение Ct на канале JOE/Yellow больше 33, а значение Ct по каналу FAM/Green не превышает 28, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале JOE/Yellow менее 33.

2. Образцы, для которых отсутствует значение Ct как по каналу JOE/Yellow, так и по каналу FAM/Green, или получено значение Сt по каналу FAM/Green более 28 для клинического материала и 25 для образцов окружающей среды требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае если повторно получен аналогичный результат, требуется повторить анализ образца, начиная с этапа выделения.

3. Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного образца (на канале JOE/Yellow) и для отрицательного контроля ПЦР (ТЕ-буфер) (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА.

Анализ результатов амплификации ВКО.

1. Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», для канала «Cycling A. FAM»/«Cycling A. Green» отметить Page1/Стр.1 и нажать кнопку «Show»/«Показать».

2. Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должны быть активированы кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррек. уклона».

4. В меню окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов» установить значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) - 10%.

5. Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкалавидна кнопка Log scale/Лог. Шкала).

6. В меню «CT Calculation»/«Вычисление CT» (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.05.

7. В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные Результаты») появятся значения Ct.

8. Расчет количества копий ДНК ВКО-STI-338 в 1 мл тестируемой пробы проводится автоматически программой прибора по заданным значениям калибраторов, и полученное значение появляется в соответствующей графе в таблице результатов (Calcconc/Конц. Рассч.).

Анализ результатов амплификации ДНК Legionella pneumophila.

1. Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», для канала «Cycling A. JOE»/«Cycling A. Yellow» отметить Page2/Стр.2 и нажать кнопку «Show»/«Показать».

2. Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должны быть активированы кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррек. уклона».

4. В меню окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов» установить значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) - 10%.

5. Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкалавидна кнопка Лог. Шкала).

6. В меню «CT Calculation»/«Вычисление CT» выставить Threshold/Порог = 0.05.

7. В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные Результаты») появятся значения Ct.

8. Расчет количества копий ДНК Legionella pneumophila в 1 мл тестируемой пробы проводится автоматически программой прибора по заданным значениям калибраторов, и полученное значение появляется в соответствующей графе в таблице результатов (Calcconc/Конц. Рассч.).

Учет результатов количественного анализа.

Значение коэффициента R² (коэффициента корреляции) должно быть не менее 0.97.

Показатель эффективности амплификации (Efficiency) должен находиться в пределах 0,85 – 1.15.

Расчет концентрации ДНК Legionellapneumophila в 1 л воды (С _{ДНК Lp} (копий / л))проводят вручную или с использованием программного обеспечения, прилагающегося к комплекту реагентов, по следующей формуле:

С _{ДНК Lp}(копий / л) = К _{ДНК Lp}/ К _{ВКО-STI-338}* С _{ВКО-STI-338} * 2, где

К _{ДНК Lp} (копий / мл) = Расчетное количество копий ДНК Legionella pneumophila в 1 мл тестируемой пробы,

К _{ВКО-STI-338} (копий / мл) = Расчетное количество копий ДНК ВКО-STI-338 в 1 мл внутреннего контрольного образца в тестируемой пробе,

С _{ВКО-STI-338} (копий / мл) = Количество копий ДНК ВКО-STI-338 в 1 мл внутреннего контрольного образца (значение указано во вкладыше к набору реагентов),

2 – коэффициент пересчёта.

Расчетная концентрация контрольной пробы «ПК» Legionella pneumophila должна находитьсяв пределах заданного во вкладыше к набору реагентов диапазона.

Результаты анализа не подлежат учету если:

1. В таблице результатов для отрицательного контроля выделения на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля ПЦР на любом из каналов появляется любое значение Ct, что свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

2. Значение концентрации ДНК Legionella pneumophila в контрольном образце выделения ДНК (ПК) не укладывается в диапазон, указанный во вкладыше, значит, допущена ошибка либо на этапе выделения ДНК, либо на этапе проведения амплификации. Необходимо повторно провести ПЦР-анализ.

3. Количество копий ДНК ВКО-STI-338 в 1 мл тестируемой пробы ниже среднего значения концентрации ДНК препарата ВКО-STI-338, указанного во вкладыше к набору реагентов, более чем в 5 раз. Это свидетельствует о низкой эффективности выделения ДНК из данного образца или о неэффективной очистке от ингибиторов – необходимо протестировать образец повторно, начиная с этапа выделения ДНК.

Лист вносимых изменений