Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Меню

Категории

05.05.2010

Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ФГУН ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

Методические рекомендации

Исследование клинического материала
на наличие ДНК возбудителей ИППП и других
инфекций органов репродукции методом ПЦР
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Перечень наборов реагентов «АмплиСенс®» производства ФГУН ЦНИИЭ
для выявления ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Выявляемые микроорганизмы (возбудители инфекций)	Наборы реагентов
Бактериальные инфекции
*Chlamydia trachomatis*	«АмплиСенс® Chlamydia trachomatis-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Neisseria gonorrhoeae*	«АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-скрин-FL» «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-тест-FL» «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Treponema pallidum*	«АмплиСенс® Treponema pallidum-FL»
*Mycoplasma genitalium*	«АмплиСенс® Mycoplasma genitalium -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum*	«АмплиСенс® Ureaplasma spp.-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Mycoplasma hominis*	«АмплиСенс® Mycoplasma hominis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*Gardnerella vaginalis*	«АмплиСенс® Gardnerella vaginalis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Вирусные инфекции – герпесвирусы
*HSV I, II*	«АмплиСенс® HSV I , II-FL» «АмплиСенс® HSV- typing-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
*CMV*	«АмплиСенс® CMV -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Протозойные инфекции
*Trichomonas vaginalis*	«АмплиСенс® Trichomonas vaginalis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Грибковые инфекции
*Candida albicans*	«АмплиСенс® Candida albicans -FL»
Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei	Набор серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Одновременно выявляемые микроорганизмы	Наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp. / Mycoplasma genitalium	«АмплиСенс® C. trachomatis / Ureaplasma / M. genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp./ Mycoplasma hominis	«АмплиСенс® C. trachomatis / Ureaplasma / M. hominis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
*Neisseria gonorrhoeae /* *Chlamydia trachomatis /* *Mycoplasma genitalium /* *Trichomonas vaginalis*	«АмплиСенс® N.gonorrhoeae / C.trachomatis / M.genitalium / T.vaginalis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp. / Mycoplasma genitalium / *Mycoplasma hominis*	«АмплиСенс® C.trachomatis / Ureaplasma /M.genitalium / M.hominis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
*Neisseria gonorrhoeae /* *Chlamydia trachomatis /* *Mycoplasma genitalium /*	АмплиСенс® N.gonorrhoeae / C.trachomatis / M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
*HSV I / HSV II*	«АмплиСенс® HSV-typing -FL»
*Ureaplasma parvum / Ureaplasma urealyticum*	«АмплиСенс® U.parvum / U.urealyticum-FL» (выявление и дифференциация)
Trichomonas vaginalis / Neisseria gonorrhoeae	«АмплиСенс® T.vaginalis / N.gonorrhoeae -МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
*Chlamydia trachomatis /* *Ureaplasma spp.*	АмплиСенс® C.trachomatis / Ureaplasma -МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (FEP)
*Chlamydia trachomatis /* *Mycoplasma genitalium*	АмплиСенс® C.trachomatis / M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (FEP)
Candida albicans / Candida glabrata / Candida krusei /	«АмплиСенс® C.albicans / C.glabrata / C.krusei-FL»
*HSV / CMV*	«АмплиСенс® HSV / CMV-FL»

В настоящих методических рекомендациях применяются следующие сокращения и обозначения:

ВКО-FL	- внутренний контрольный образец для наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
ИППП	- инфекции, передаваемые половым путем
ОКО	- отрицательный контрольный образец
ПКО	- положительный контрольный образец
ПЦР	- полимеразная цепная реакция
ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора	- Федеральное государственное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
FEP	- флуоресцентная детекция по «конечной точке»
FRT	- флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
МУЛЬТИПРАЙМ	- серия наборов для одновременного выявления ДНК нескольких микроорганизмов в одной ПЦР

Выявление микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа: экстракцию (выделение) ДНК из образцов клинического материала, амплификацию фрагмента ДНК данного микроорганизма и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится либо непосредственно в ходе ПЦР (вариант FRT), либо после ее завершения (вариант FEP). Экстракция ДНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-FL), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами ДНК проводится реакция амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма при помощи специфичных к нему праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. К олигонуклеотидным зондам, специфичным к различным ДНК-мишеням, прикреплены различные флуоресцентные метки. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации каждой ДНК-мишени путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по соответствующему каналу.
Детекция флуоресцентного сигнала при использовании варианта FEP осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, а при использовании варианта FRT – непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». В обоих случаях детекция результатов ПЦР осуществляется без извлечения продуктов реакции из пробирок, что позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами ПЦР. Дополнительным преимуществом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией является возможность автоматизировать учет результатов анализа, снизить субъективизм в интерпретации результатов.
Преимуществом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией являются также широкие возможности проведения мультиплексного ПЦР-анализа, т.е. одновременное проведение амплификации и детекции нескольких ДНК-мишеней (ДНК нескольких микроорганизмов) с помощью одной реакции. При этом благодаря проведенной оптимизации сохраняется высокая чувствительность в отношении каждой из выявляемых ДНК-мишеней. Использование мультиплексной ПЦР позволяет повысить производительность выполнения анализа в три-четыре раза без увеличения приборной базы лаборатории.
Для мультиплексного ПЦР-анализа с гибридизационно-флуоресцентной детекцией предназначены наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ».

Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I – IV групп патогенности».
Исследование разделяется на три этапа и проводится в трех помещениях (ЗОНАХ):
В ЗОНЕ 1 проводится первичный разбор, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и предварительная обработка клинического материала.
В ЗОНЕ 2 проводится экстракция ДНК из клинического материала.
В ЗОНЕ 3 проводится подготовка пробирок для проведения ПЦР и проведение ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной детекции.

При работе всегда следует выполнять следующие требования:

Использовать наконечники с фильтрами для автоматических дозаторов. Для каждой процедуры использовать новый наконечник.
Следует рассматривать образцы как потенциально вызывающие инфекцию и хранить в биологическом кабинете в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
Уничтожать образцы и неиспользованные реактивы в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

ВНИМАНИЕ! При утилизации пробирок, содержащих продукты ПЦР после амплификации, недопустимо их открывание и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами амплификации лабораторной зоны, оборудования и реагентов.
Интерпретация результатов и внесение готовых результатов в журнал проводит аккредитованный врач-лаборант.
Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания.

Для взятия клинического материала:
Транспортная среда - «Транспортная среда с муколитиком (ТСМ)» (ТУ 9398-098-01897593-2009) или «Транспортная среда для мазков» (ТУ 9398-088-01897593-2009), или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (при работе с формами комплектации 1–3).
Для предобработки клинического материала и проведения экстракции ДНК из клинических образцов (ЗОНЫ 1-2):

Комплект реагентов для выделения ДНК - «ДНК-сорб-АМ» (ТУ 9398-036-01897593-2009) или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Бокс биологической безопасности (бокс абактериальной воздушной среды)
2 класса защиты (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).
Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).
Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, «Axygen», США).
Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
Отдельный халат и одноразовые перчатки.
Емкость с дезинфицирующим раствором.
Одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов.

Для проведения амплификации и флуоресцентной детекции (ЗОНА 3):

Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
Центрифуга/вортекс.
Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до 20 мкл, при работе с «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F – от 5 до 20 мкл и от 20 до 200 мкл).
Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл в штативах.
Штативы для микропробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с используемыми комплектами реагентов). Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных проб ДНК.
Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.1888-04.
Емкость для сброса наконечников.

При работе с «ПЦР-комплектом» вариант FEP:

Программируемый амплификатор (например, «Терцик» («ДНК-Технология», Россия), «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research», Австралия), «MAXYGENE» («Axygen», США), «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems») или аналогичные).
Флуоресцентный ПЦР-детектор (например, «AЛА-1/4» («BioSan», Латвия), «Джин» («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
Пластиковая пипетка для минерального масла (для работы с «ПЦР-комплектом» вариант FEP-1000).

При работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT:
8. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» – при работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT (например, «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия), «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия), «iQ5» («Bio-Rad», США), «Mx3000P» («Stratagene», США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
9. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл – при работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT-100 F:
а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой крышкой (например, «Axygen», США) – при использовании прибора планшетного типа;
б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой (например, «Axygen», США), или пробирки для ПЦР к «Rotor-Gene», объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (например, «Corbett Research», Австралия; «Qiagen», Германия) – при использовании прибора роторного типа.

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2008 г.
Материалом для исследования служат: соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, прямой кишки, ротоглотки; отделяемое конъюнктивы глаз, эрозивно-язвенных элементов слизистых и кожи; моча (первая порция мочи), секрет предстательной железы человека.

Для проведения анализа, как правило, используются следующие виды клинического материала:

У женщин: соскобное отделяемое слизистых оболочек цервикального канала, влагалища, уретры; моча.
У мужчин: соскобное отделяемое слизистой оболочки уретры, моча, секрет предстательной железы.
У детей: моча, отделяемое конъюнктивы глаз.

Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, рекомендованной ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Полученные образцы (кроме образцов мочи) можно транспортировать и хранить в следующих режимах:

при комнатной температуре – в течение 48 часов;
при температуре от 2 до 8 °С – в течение двух недель;
при температуре не выше мину 20 °С – в течение месяца;
при температуре не выше минус 68 °С – длительно.

Полученные образцы, помещенные в транспортную среду с муколитиком (ТСМ), можно транспортировать и хранить:

при комнатной температуре (от 18 до 25 °С) до 28 суток;
при температуре от 2 до 8 °С до 3 месяцев;
при температуре не выше минус 20 °С – длительно.

Допускается однократное замораживание-оттаивание клинических образцов.
Полученные образцы мочи можно транспортировать и хранить:

при комнатной температуре – в течение 6 часов;
при температуре от 2 до 8 °С – в течение суток;

Доставка клинических образцов осуществляется в специальном контейнере с охлаждающими элементами.
Для проведения исследования на наличие ДНК определенного микроорганизма анализируются следующие виды клинического материала:
- для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma spp.,U.parvum / U.urealyticum, Mycoplasma hominis–соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, образцы мочи, секрет предстательной железы человека.
- для выявления ДНК Chlamydia trachomatisи Neisseria gonorrhoeae возможно также исследовать отделяемое конъюнктивы глаз, соскобное отделяемое слизистых оболочек прямой кишки, ротоглотки.

для выявления ДНК HSVI и II типов, Treponema pallidum– соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, прямой кишки, ротовой полости, отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний) и эрозивно-язвенных поражений кожи и слизистых оболочек.
для выявления ДНК HSVI и II типов можно также исследовать цельную кровь и ликвор, отделяемое конъюнктивы глаз.
для выявления ДНК CMV – соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, моча, слюна и цельная кровь.
для выявления ДНКCandida albicans– соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, ротовой полости; моча.
для выявления ДНКGardnerella vaginalis– соскобное отделяемое слизистой оболочки влагалища.

При использовании секрета предстательной железы, цельной крови или ликвора для экстракции ДНК рекомендуется использовать комплект реагентов «ДНК-сорб-B».

ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

Экстракция (выделение) ДНК из исследуемых (клинических) образцов;
Проведение амплификации (вариант FEP) или амплификации с детекцией в режиме «реального времени» (вариант FRT) *.
Флуоресцентная детекция продуктов амплификации (вариант FEP).
Анализ и интерпретация результатов.

*) При использовании ПЦР-комплектов вариант FRT проводят ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», т.е. совмещают этапы амплификации и детекции продуктов амплификации. При использовании ПЦР-комплектов вариант FEP флуоресцентная детекция проводится отдельным этапом после завершения амплификации («по конечной точке»).

Для экстракции (выделения) ДНК используются наборы реагентов, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, в соответствии с инструкцией к используемому набору. Экстракция ДНК из каждого клинического образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца – ВКО-FL.
При использовании набора реагентов, включающего комплект «ДНК-сорб-АМ», для экстракции ДНК используется входящий в набор комплект «ДНК-сорб-АМ» (за исключением экстракции из образцов клинического материала, для которого рекомендуется использовать комплект «ДНК-сорб-B»).

Предварительная обработка образцов клинического материала
(требуется только для образцов мочи)
Взболтать флакон с мочой. Перенести 1 мл мочи в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл, используя отдельный наконечник с фильтром для каждого образца. Центрифугировать 5 мин при 10000 g (12 тыс об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf). При наличии большого количества солей ресуспендировать только верхний слой осадка солей в объеме 1 мл и затем снова центрифугировать. Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удалить надосадочную жидкость, не захватывая осадок и используя для каждого образца отдельный наконечник (без фильтра). К осадку добавить транспортную среду до конечного объема 0,2 мл. Тщательно перемешать содержимое пробирки на вортексе.
Предварительно обработанные образцы мочи (осадок мочи в транспортной среде) можно хранить

при температуре от 2 до 8 °С – в течение суток;
при температуре не выше минус 20 °С – в течение недели;
при температуре не выше минус 68 °С – длительно.

А. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-АМ»

Принцип метода экстракции
Клинический образец (клинический материал, помещенный в транспортную среду) обрабатывается лизирующим раствором в присутствии частиц силики – сорбента. В результате происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение ДНК. Растворенная ДНК в присутствии лизирующего раствора связывается с частицами сорбента, в то время как другие компоненты лизированного клинического материала остаются в растворе и удаляются при осаждении сорбента центрифугированием и последующей отмывкой. При добавлении раствора для элюции ДНК к сорбенту происходит переход ДНК с поверхности силики в раствор, который отделяется от частичек сорбента центрифугированием. В результате указанной процедуры получается высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность ПЦР-исследования.

Состав комплекта «ДНК-сорб-АМ»

*Реагент*	*Описание*	*Вариант 50*		*Вариант 100*
*Реагент*	*Описание*	*Объем (мл)*	*Кол-во*	*Объем (мл)*	*Кол-во*
Лизирующий раствор	Раствор, содержащий хаотропный агент	15	1 флакон	30	1 флакон
Отмывочный раствор	Раствор, содержащий этиловый спирт	50	1 флакон	100	1 флакон
Сорбент универсальный	Суспензия частиц силики	1,0	1 пробирка	1,0	2 пробирки
ТЕ-буфер для элюции ДНК	Буферный раствор для элюции ДНК	5,0	1 пробирка	5,0	2 пробирки

Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются следующие реагенты:

*Реагент*	*Описание*	*Вариант 50*		*Вариант 100*
*Реагент*	*Описание*	*Объем (мл)*	*Кол-во*	*Объем (мл)*	*Кол-во*
ВКО комплексный	Раствор, содержащий фрагменты ДНК ВКО (в составе генно-инженерных конструкций)	1,0	1 пробирка	1,0	1 пробирка
ВКО-FL	Раствор, содержащий фрагмент ДНК ВКО-FL (в составе генно-инженерных конструкций)	1,0	1 пробирка	1,0	1 пробирка
ОКО	Транспортная среда	1,2	1 пробирка	1,2	1 пробирка

Подготовка к проведению экстракции ДНК

Включить термостат и установить температуру 65 °С.
Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) следует прогреть, перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов (кристаллы могут образовываться на дне флакона).
Подготовить и расставить в штативе необходимое количество одноразовых стерильных полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл, промаркировать их.
Подготовить и расставить в штативе пробирки с клиническими образцами. Перед проведением процедуры экстракции нуклеиновых кислот осадить капли материала со стенок пробирки и внутренней части крышки центрифугированием (1500-3000 об/мин в течение 5 с), после чего аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе, избегая разбрызгивания и попадания материала на внутреннюю часть крышки.
При использовании первой порции мочи для исследования образцов провести предварительную обработку с целью получения образцов осадка мочи в транспортной среде, как описано в разделе выше.

Процедура экстракции ДНК

В подготовленные одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки внести по 10 мкл ВКО-комплексного или ВКО-FL в зависимости от метода детекции продуктов ПЦР (см. «Состав комплекта»). При использовании наборов реагентов с разными методами детекции допускается внесение двух препаратов внутреннего контрольного образца по 10 мкл каждого.
Ресуспендировать сорбент и внести в каждую пробирку по 20 мкл сорбента универсального, после чего внести по 300 мкл лизирующего раствора, используя наконечники с аэрозольным барьером.

Примечание. Если количество обрабатываемых клинических образцов составляет более 50 за рабочую смену, рекомендуется добавить весь объем сорбента и ВКО во флакон с лизирующим раствором (2 мл сорбента универсального и 1 мл ВКО на 30 мл лизирующего раствора). Полученную суспензию тщательно перемешать и внести по 330 мкл в подготовленные пробирки. Допускается хранение смеси не более 2 сут при комнатной температуре. Перед применением суспензию тщательно перемешать.

Внести по 100 мкл клинического образца, используя для каждой пробы отдельный наконечник с фильтром. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100 мкл ОКО.
Пробирки плотно закрыть, содержимое тщательно перемешать на вортексе и инкубировать 5 мин при 65 °С в термостате. После окончания инкубации содержимое повторно перемешать на вортексе и оставить при комнатной температуре на 2 мин.
Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 10 тыс об/мин в течение 30 с. Не захватывая сорбент, удалить надосадочную жидкость в колбу-ловушку с помощью вакуумного отсасывателя, используя для каждой пробы отдельный наконечник без фильтра.
Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.
Повторить п. 5.
Поместить пробирки в термостат с температурой 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента, при этом крышки пробирок должны быть открыты.
В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, используя наконечник с фильтром. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Поместить в термостат с температурой 65 °С на 5 мин. Допускается при необходимости увеличение объема элюции до 150 мкл.
Центрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Полученные пробы ДНК можно хранить в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С или в течение года при температуре не выше минус 16 °С.
При повторном исследовании проб, содержимое пробирок необходимо перемешать на вортексе и повторить центрифугирование в соответствии с п.10.

Б. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-B»

Принцип метода экстракции
Принцип метода экстракции при использовании комплекта реагентов «ДНК-сорб-B» соответствует описанному выше для методики экстракции с использованием комплекта «ДНК-сорб-АМ».
Состав комплекта «ДНК-сорб-B»

*Реагент*	*Описание*	*Вариант 50*		*Вариант 100*
*Реагент*	*Описание*	*Объем (мл)*	*Кол-во*	*Объем (мл)*	*Кол-во*
Лизирующий раствор	Раствор, содержащий хаотропный агент	15	1 флакон	30	1 флакон
Раствор для отмывки 1	Раствор, содержащий хаотропный агент и этиловый спирт	15	1 флакон	30	1 флакон
Раствор для отмывки 2	Раствор, содержащий этиловый спирт	50	1 флакон	100	1 флакон
Сорбент универсальный	Суспензия частиц силики	1,25	1 пробирка	1,25	2 пробирки
ТЕ-буфер для элюции ДНК	Буферный раствор для элюции ДНК	5,0	1 пробирка	5,0	2 пробирки

Подготовка к проведению экстракции ДНК

Включить термостат и установить температуру 65 °С.

Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) следует прогреть, перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.

Подготовить и расставить в штативе необходимое количество одноразовых стерильных полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл и промаркировать их.
Подготовить и расставить в штативе пробирки с клиническими образцами. Перед проведением процедуры экстракции нуклеиновых кислот осадить капли материала со стенок пробирки и внутренней части крышки центрифугированием (1500-3000 об/мин в течение 5 с), после чего аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе, избегая разбрызгивания и попадания материала на внутреннюю часть крышки.

Процедура экстракции ДНК

В подготовленные одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки внести по 10 мкл ВКО-комплексного или ВКО-FL в зависимости от метода детекции продуктов ПЦР. При использовании наборов реагентов с разными методами детекции допускается внесение двух препаратов внутреннего контрольного образца по 10 мкл каждого.
В каждую из подготовленных пробирок внести по 300 мкл лизирующего раствора.
В пробирки с лизирующим раствором и ВКО внести по 100 мкл клинического образца, используя наконечники с фильтром. В пробирку отрицательного контроля (ОК) выделения внести 100 мкл ОКО.
Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе, затем инкубировать 5 мин при температуре 65 °С. Центрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, центрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс об/мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.
Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин.
Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального.
Повторить п. 6.
Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального.
Осадить сорбент центрифугированием при 10 тыс об/мин в течение
30 с на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Повторить процедуру отмывки, следуя пп. 9-10, удалить надосадочную жидкость полностью.
Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5-10 мин. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
В пробирки внести по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать содержимое пробирок на вортексе. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
Центрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Полученные пробы ДНК можно хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение года при температуре не выше минус 16 °С.

Возврат к списку

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПРИНЦИП МЕТОДА

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

А. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-АМ»

Подготовка к проведению экстракции ДНК

Б. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-B»

Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) следует прогреть, перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.