Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности.

Приложение 5

Порядок обработки и обеззараживания исследуемого материала,

содержащего (подозрительного на содержание)  микроорганизмы I-IV групп патогенности, при проведении работ с использованием

амплификационных технологий

         1. Исследуемый материал может быть представлен чистыми культурами микроорганизмов, биологическим или секционным материалом от человека и животных, насекомыми, пищевыми продуктами, смывами с поверхностей, фильтратами  почвы и т.д. (Приложение 2).

2. Обработка исследуемого материала, инфицированного бактериями I–IV групп патогенности и возбудителями глубоких микозов.

2.1. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I–II групп патогенности (бактериями, не образующими споры, хламидиями, риккетсиями и возбудителями глубоких микозов), проводится следующим способом:

К исследуемому образцу добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревают его при 56 ⁰С в течение 30 мин. Затем, 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата, в объеме указанном в инструкции по применению к набору реагентов и инкубируют 15 мин при 65 ⁰С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

2.2. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами III-IV групп патогенности (вирусами, хламидиями, риккетсиями и бактериями, не образующими споры) проводится одним из следующих способов:

2.2.1. Способ-1. Прогревание исследуемого образца при 100 ⁰С в течение 30 мин. 

2.2.2. Способ-2. К 100 мкл исследуемого образца добавляют лизирующий раствор,  приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов (тест-системе) с последующей его инкубацией в течение 15 мин. при 65 ⁰С.

После выполнения процедуры 2.2.1. или 2.2.2. материал считается обеззараженным.

2.3. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) бактериями II–IV групп патогенности, образующими споры, проводится следующим способом:

Исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера, рН 7,2 и инкубируют с аэрацией при 37 ⁰С в течение 2,5 ч. Добавляют пенициллин до конечной концентрации 1000 ед/мл и инкубируют при 37 ⁰С в течение 15 мин. После инкубации с пенициллином, исследуемый материал прогревают на водяной бане в течение 10 мин. при температуре       100 ⁰С. Затем 100 мкл обработанного образца переносят в пробирки объемом 1,5 мл и добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов, и инкубируют 15 мин при 65 ⁰С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусами I–II групп патогенности.

3.1. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусом натуральной оспы, проводится следующим способом:

Материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 400 мкл лизирующего буферного раствора, содержащего 100 мМ Tрис-HCl (pH=8), 100 мM ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% SDS, и инкубируют 10 мин при температуре 65 ^оС. Добавляют 50 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл), перемешивают и инкубируют в течение 1 часа при 56 ^оС. Центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об/мин для осаждения нерастворенных частиц. Супернатант переносят в стерильные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют равный объема смеси фенол/хлороформ (pH 8,0) и тщательно перемешивают. Затем центрифугируют в течение 5 мин при 10000 g. Переносят верхнюю водную фазу, содержащую раствор фенола и ДНК, в новую пробирку, добавляют 1/10 по объему 3 М ацетата натрия (pH 5.5), 30–40 мкг РНК-носителя (1 мкл раствора РНК-носителя с концентрацией 30–40 мкг/мкл) и равный объем изопропанола. Затем центрифугируют в течение 15 мин при 10000 g при 4 ⁰С. Полученный осадок промывают добавлением 1 мл 70 % этанола и центрифугированием в течение 5 мин при 14000 об/мин при 4 ⁰С.

После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.2. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусами I–II групп патогенности (кроме вируса оспы), содержащего инфекционную (позитивную) РНК, проводится следующим способом:

Материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1), и инкубируют 20 мин при температуре 65 ⁰С. Затем выделяют РНК, используя метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента, либо метод осаждения РНК этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия. Обратную транскрипцию выполняют в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов. Затем в образцы с кДНК добавляют РНКазу А до конечной концентрации 25 мкг/мл. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.3. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) вирусами I-II групп патогенности, содержащих неинфекционную (негативную) РНК или ДНК проводится следующим образом:

Материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера, на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1) и инкубируют 20 мин при температуре 65 ⁰С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.4. Обработка исследуемого материала, подозрительного на
инфицирование высокопатогенным неизвестным возбудителем, проводится в соответствии с пп. 2.3. и (или) 3.1. Работа с таким материалом, на всех этапах исследования, осуществляется с применением специальных средств индивидуальной защиты согласно Приложению 4. 

4. В Рабочие зоны 2, 3, 4-1 и 4-2 передаются только обработанные пробы, не содержащие инфекционный материал.

5. Обеззараживание остатков исследуемого материала в Рабочей зоне 1 осуществляют в соответствии с СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08.